葡萄酒中的有机酸及检测方法研究进展

丁仁君 夏延斌

DING Ren－junXIA Yan－bin

（湖南农业大学食品科技学院，湖南 长沙 410128）

（College of Food Science and Technology，Hunan Agriculture University，Changsha，Hunan 410128，China）

葡萄酒作为人类较早的酒精饮料之一，有着悠久的历史和文化底蕴。考古发现人类在1万年前的新石器时代就开始采集野生葡萄果实鲜食及酿造葡萄酒［1］。在中国的历史长河中，葡萄酒一直是作为皇宫贵族的饮品，在唐宋鼎盛时期，民间也有自酿自饮葡萄酒的风气。根据中国著名的医典《本草纲目》记述，葡萄酒有“暖肾腰、驻颜色、耐寒”等神奇功效。由此可见，古人对葡萄酒的独到认识和喜爱。

随着科学技术的发展，西方营养学的进步，人们发现了葡萄酒中更多的秘密和独特作用。葡萄酒对人体有益的物质多达上百种，如各种有机酸、酚类、维生素、矿物质等等。虽然有些物质含量不高，但被人体吸收利用率极高。为深入了解葡萄酒的保健功能，科学技术人员还开展了较多的动物和人体试验。发现葡萄酒中的白藜芦醇具有抑制肿瘤［2］、保护心血管［3－5］、抗氧化［6］、清除自由基、预防糖尿病性心肌病［7］等功效；葡 萄 酒 中 的 花 色 苷，具 有 抗 癌［8，9］、降 血 脂［10］、抗氧化［11，12］、抗炎［13］等功效。葡萄酒中的有机酸能反映葡萄原料的特性和酒的风味特性，也能反映酿造工艺的特点，因此近年来相关研究越来越多。

1 葡萄酒中的有机酸种类及其对风味的影响

葡萄酒的酿造过程是酵母菌将葡萄中的糖类转化为酒精的过程，整个过程中有多达几十种有机酸参与反应，主要有以下种类。

1.1 酒石酸（tartaric acid）

2，3－二羟基丁二酸，在葡萄果实中大量存在，在成品酒中的含量为1.5～2.5 g／L。酒石酸的酸性很强，最容易解离，所以酒体的p H受酒石酸含量的影响很大。在葡萄酒发酵初期，为抑制杂菌的生长，常常会人为的用葡萄汁将酒石酸溶解，然后加入到发酵容器中，使整体的p H值降低，而促进正常的酒精发酵。在发酵过程中，由于细菌的新陈代谢，酒石酸会被消耗掉一部分，而其他的酒石酸会部分转变成酒石酸盐沉淀［14］。葡萄酒中的酒石酸含量过高时，酒味会变的粗硬，有涩敛感，从而降低葡萄酒的品质［1］。

1.2 苹果酸（malic acid）

2 －羟基丁二酸，在自然中有D－、L－、DL－3种存在形式，成品酒中的含量为1.5～3.0 g／L。水果中绝大部分含有L－苹果酸，随着成熟度的提高，其含量会慢慢降低。在葡萄酒酿造时，当酒精发酵基本结束后，会进入苹果酸－乳酸发酵（MLF）阶段，即在乳酸菌的作用下，将L－苹果酸分解为L－乳酸和CO2的过程。对于整个酒体来说，降低了酸涩度，粗糙度和色度等，该发酵过程生成的醛类、酯类等能很好的修饰酒的风味，对于酒的品质形成不可或缺。p H升高的同时，可降低生酒的生青味和苦涩感，能使酒体更柔和、圆润［15］。目前，已经可以通过一些人工的手段对MLF过程进行干扰或调控，以达到理想的葡萄酒风味和稳定性［16］。

1.3 柠檬酸（citric acid）

2 －羟基丙烷－1，2，3－三羧酸，有温和爽快的酸味，在成品酒中的含量为0.10～0.15 g／L。在各种葡萄果实中均含有柠檬酸，但因酿造工艺不同，不同种类葡萄酒中的柠檬酸含量差别很大。在TCA循环中柠檬酸仅是中间产物，最终被消耗掉。而在苹果酸－乳酸发酵的过程中，乳酸菌在同时分解消耗柠檬酸，产生呈香物质双乙酰（2，3－丁二酮）及其衍生物2，3－丁二醇等，所以红葡萄酒的酿造中几乎耗掉所有的柠檬酸。

1.4 乳酸（lactic acid）

2 －羟基丙酸，有D－、L－型两种，成品酒中的含量为0.18～0.40 g／L。乳酸的主要来源是酒精发酵和 MLF发酵，酵母菌发酵产生D－乳酸，MLF发酵形成L－乳酸。乳酸的酸味很强，但酸味较温和。如果酿造过程中未被细菌污染，其在葡萄酒中的含量不会太高。

1.5 乙酸（acetic acid）

又名醋酸，具有很强烈的酸味，是酵母菌发酵的常规代谢产物，主要在发酵初期产生，是酒类中主要的挥发酸，在酒体中的含量低于0.4 g／L。乙酸可与乙醇形成酒的特征香味物质——乙酸乙酯。在发酵后期或陈酿过程中，如果未能很好的隔绝氧气或被其他细菌污染，大量乙醇就会转变为乙酸，说明酒体已酸败变质。

1.6 琥珀酸（succinic acid）

即丁二酸，在成品酒中的含量为0.6～1.5 g／L。在酵母菌发酵的过程中，经三羧酸循环均会代谢产生琥珀酸；MLF过程中，苹果酸会转化为琥珀酸；还有一部分来自谷氨酸的转化。琥珀酸的味感复杂，有酸味又有苦味，参与酒味的形成。由于各地的气候、葡萄品种、土壤等差异，导致葡萄原料中的C源、N源含量不同，所以各地区的葡萄酒中琥珀酸含量差别较大。

1.7 富马酸（fumaric acid）

又名延胡索酸，反丁烯二酸，是柠檬酸三羧酸循环中的中间代谢产物之一，由苹果酸脱去一个水或琥珀酸经脱氢酶作用形成。富马酸的酸味纯正，酸感强，但在葡萄酒中的含量极低，对酒的酸味影响很小。

1.8 丙酮酸（pyruvic acid）

又叫2－氧代丙酸，是糖酵解过程中，磷酸烯醇丙酮酸在丙酮酸激酶的作用下，生成丙酮酸；丙酮酸在脱羧酶、脱氢酶的作用下，先转变成乙醛，再转变为乙醇。葡萄酒中的丙酮酸含量不高，约为0.05～0.10 g／L［14］，大部分被分解，对整体风味无显著的影响。

1.9 乙醛酸（glyoxylic acid）

在乙醛酸循环中，异柠檬酸在裂解酶的作用下生成，还有一部分是由甘氨酸在氧化酶的作用下形成。乙醛酸有不愉快的香味，但在整个发酵中，其仅是中间代谢产物，在最终的葡萄酒中乙醛酸含量极低，故其对整体的风味影响可以忽略。

1.10 其他

除此之外，葡萄酒中还有α－酮戊二酸、草酸、莽草酸、糖醛酸、葡萄糖酮酸、半乳糖二酸等多种有机酸，这些酸在葡萄酒中的含量微乎其微，对酒的风味影响不大。

2 有机酸的检测方法

随着色谱技术的成熟和推广，食品中有机酸的测定技术得到了快速发展。GB／T 15038－2006［17］葡萄酒、果酒通用分析方法中规定了HPLC法测定有机酸的方法，尽管该标准仅发布几年，但其方法的局限性很明显，如，前处理中要进行固相萃取柱的活化、洗脱并收集样品，才能进行测定，甚为繁琐。学者们更希望有简便、快速的检测方法，所以在国标的基础上，对前处理方法、检测条件等进行优化，获得了一些较好的成果。

2.1 RP－HPLC法

液相色谱检测葡萄酒中的有机酸占利用色谱技术检测有机酸的70%以上，准确率、重复性、便捷性均优于其他检测方法。表1是液相色谱法检测有机酸的方法比较。

根据表1所列方法，可以归纳出RP－HPLC法检测葡萄酒中有机酸的要点：流动相需经0.45μm滤膜过滤脱气后方可使用；经发酵、陈酿后，大部分有机酸已经转移到酒体中，故样品经离心或不离心，稀释定容后过0.45μm微膜，方可上机检测。色谱条件：配VWD检测器，ODS或性能相当的色谱柱，250×4.6 mm，5μm，检测波长210 nm，柱温25～30℃，流速0.6～0.8 mL／min，进样5或10μL（视机器而定），以0.01 mol／L的磷酸盐缓冲液，p H 2.7～3.0的 K2HPO4或（NH4）2HPO4溶液作流动相进行检测，在这些基本条件下各种酸的分离度、相关系数、回收率都较高。如胡小露等［25］进行9种有机酸的精密度试验，平均RSD可达0.15%（n＝6）；进行重复性试验，平均RSD可达0.35%（n＝6）；加标回收率试验，平均回收率为99.52%，平均 RSD为0.019%（n＝5）；发酵结束后，每隔10 d连续取样4次进行测定，也未出现杂峰对目标物质的干扰。其他学者的回收率也都较高，由此可见，RP－HPLC法测葡萄酒中的有机酸，安全、快速、可靠，而且操作简便，是检测有机酸的首推方法。

2.2 其他色谱检测方法

2.2.1 衍生化气相色谱法 气相色谱使用成本较低，且对环境相对友好。杜曦等［27］通过酯化方法的比较，筛选出碘乙烷衍生化处理方法，用福力GC9790气相色谱仪，SP－30毛细管柱，程序升温法，同时测定了葡萄酒中的丙二酸、琥珀酸、苹果酸、戊二酸、酒石酸、己二酸、柠檬酸，分析时间16 min。各种酸的分离度很好，且回收率可达95.1%～98.9%。

表1 不同的液相色谱方法检测葡萄酒中的有机酸Table 1 Different method for organic acids testing in wine

表1 不同的液相色谱方法检测葡萄酒中的有机酸Table 1 Different method for organic acids testing in wine

T.酒石酸；M.苹果酸；L.乳酸；A.乙酸；C.柠檬酸；F.富马酸；S.琥珀酸；O.草酸；As.抗坏血酸；I.异柠檬酸；Sh.莽草酸；－.未提及。

文献样品前处理色谱仪 柱子型号 流动相流速／（m L·min－1）柱温／℃检测波长／nm酸的种类分析时间／min进样量／μL GB／T 15038 过固相萃取柱 －Fetigsaule T 300－7，8 0.007 5 mol／L H 2 SO4溶液0.3 55 210 T，M，L，A，C，S－ 20［18］皂土处理，活性炭吸附后，微膜过滤Waters 600E Bio－Rad HP×87－H，300×7.5 mm，9μm 0.1%磷酸水溶液 0.7 55 192 C，T，M，S，L，A－ 5［19］ 离心后微膜过滤岛津LC－3A SCR－101H300×7.9 mm高氯酸调的p H 2.5 H 2 O溶液0.6 55 210 C，T，M，S，L，A 16 10［20］ 直接微膜过滤日立638－50 Hypersil 250×4.0 mm，10μm p H 2.75 0.01 mol／L（NH 4）2 HPO4 0.6 25 210 T，M，L，C，S 14 15［21］ 微膜过滤两次Waters 600E Shodex Rspak Kc－811 0.1%磷酸水溶液 0.5 65 206 C，T，M，S，L，A 16 5［22］ 离心后微膜过滤 岛津VP－ODS C18，150×4.6 mm p H 3.0 0.01 mol／L H 3 PO4－KH 2 PO4 1.0 30 215 T，M，C，S 6 －［23］将葡萄破碎后加水超声提取、稀释，再微膜过滤福立FL2200ⅡUltimate XB－C18，250×4.6 mm，5μm p H 2.0 0.01 mol／L K2 HPO4，K2 HPO4∶CH 3 OH＝97∶3 0.5 25 210 T，M，As，L，A，C 19 20［24］ 水浴震荡、离 心后，微膜过滤［25］ 直接微膜过滤Agilent 1200 Waters 600 Kromasil C18，250×4.6 mm，5μm Waters symmetry C18，250×4.6 mm，5μm p H 2.8 0.01 mol／L KH 2 PO4，KH 2 PO4∶CH 3 OH＝97∶3 p H 2.0 4 g／100 m L（NH 4）2 HPO4 0.8 25 210 1.0 室温 210 O，T，M，As，C O，T，M，I，Sh，L，A，C，S 8 10 11 5［26］ 离心后直接微膜过滤Agilent 1200 Ultimate TM AQ－C18 250×4.5 mm，4.5μm p H 2.85 0.01 mol／L（NH 4）2 HPO 4 0.8 30 210 T，M，L，A，C，F，S 15 10

2.2.2 单柱离子排斥色谱法 离子排斥色谱是离子色谱法的一个重要分支，是分离有机酸的常用方法。徐继明［28］用岛津LC－10AS离子色谱仪，CDD－6A 电导检测器，TSKgel OApak－A色谱柱，p H 3.4 2 mmol／L苯甲酸溶液作流动相，流速1.0 m L／min，进样25μL，电导检测器1μS／cm，柱温25℃±2℃，分析时间14 min，可同时对葡萄酒中的酒石酸、柠檬酸、苹果酸、甲酸、乙酸、琥珀酸进行测定。分离时间较短，相对偏差为1.8%～3.6%，回收率为97.9%～105.6%。

2.2.3 HPLC－PDA 法 Yan－jun Zheng等［29］直接将葡萄原汁或葡萄酒离心，稀释后直接经0.22μm滤膜过滤，用液相色谱二极管阵列检测法（HPLC－PDA）进行检测，可同时测定草酸、酒石酸、丙酮酸、L－苹果酸、L－抗坏血酸、L－乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸9种有机酸。色谱条件为Waters系列色谱仪，Waters－2695XE四元泵，Waters－2996 PDA 检测器，Waters Atlantis dC18色谱柱（150×4.6 mm，5μm），流速1.0 m L／min，进样10μL，检测波长为抗坏血酸243 nm，其他酸210 nm，柱温30℃，p H 2.7的0.01 mol／L KH2PO4∶乙腈＝95∶5，检测时间小于13 min，可使大部分有机酸得到良好分离。

杨东伟等［30］用固相萃取－高效液相色谱－光电二极管阵列检测法（SPE－HPLC－PDA），同时对葡萄酒中的11种有机酸进行检测，分别为草酸、乙酸、丙烯酸、琥珀酸、丙二酸、酒石酸、富马酸、柠檬酸、丙酸、苹果酸、乳酸。用Agilent 1100液相色谱仪，配二极管阵列检测器，Hypersil C18色谱柱（250×4.6 mm，5μm），流速1.0 m L／min，进样20μL，检测波长210 nm，柱温25℃，甲醇和0.5%磷酸水溶液作流动相，用梯度洗脱法，分析时间15 min。该法分析时间较短，且同时检测的有机酸种类多，分离度好。

2.2.4 RP－HPLC－CL法 吴永平等［31］用液相色谱－化学发光分析方法（RP－HPLC－CL）对葡萄酒中的苹果酸、柠檬酸、琥珀酸3种有机酸进行了分析。用葡萄酒用滤纸过滤后稀释，再微膜过滤即可进行检测。色谱条件：岛津LC－6A液相色谱仪，k BPCL超微弱发光测量仪，依利特Hypersil ODS 25μm，4.6×150 mm，流动相为p H 2.5的 HClO4溶液，流速0.8 m L／min，进样20μL，柱温为室温。分析时间仅8 min，但只能检测3种有机酸。

2.2.5 液相指纹图谱法 指纹图谱技术是近十几年来一种发展快速的对复杂物质的研究方法，已广泛应用于中草药等天然产物鉴定及其质量控制中。葡萄酒有天然属性，但有类似中药的复杂体系，故用此方法可提供丰富的鉴别信息。辛若竹等［32］用液相色谱建立有机酸指纹图谱，即用山葡萄酒建立指纹图谱库，有15个特征峰，对应15种有机酸，再将样品与指纹图谱进行对比，以确认是否为人工勾兑葡萄酒。用岛津LC 20AT液相色谱仪，Shimpack VP－ODS 色谱柱（250×4.6 mm，5μm），p H 2.9 0.02 mol／L KH2PO4溶液，KH2PO4∶CH3OH＝98∶2，流速1.0 m L／min，进样20μL，检测波长210 nm，柱温30℃，分析时间60 min。此法可很好的用来鉴别葡萄酒的真伪及原汁含量。

2.2.6 离子色谱法 离子色谱－电导检测法，是种新型的检测手段，电导检测器可以分析混合物中的常量、痕量阴阳离子。李 芳 等［33］用 Dionex ICS－2000 离 子 色 谱 仪，4 mm AS11－HC分离柱，2～40 mmol／L NaOH 溶液作梯度洗脱液，淋洗流速1.0 m L／min，进样25μL，同时对葡萄酒中的乳酸、丙酸、丁酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸6种有机酸进行了检测，分析时间33 min。

张斯等［34］用 Dionex ICS－1500离子色谱仪，IonPac AS11（250×4 mm）分析柱，0.2～25 mmol／L KOH 溶液作梯度洗脱液，淋洗流速1.0 m L／min，进样25μL，色谱池温度35℃，柱温30℃，控制电流100 m A，对进口葡萄中的9种有机酸同时进行了检测，分别为乳酸、乙酸、丙烯酸、山梨酸、苯甲酸、苹果酸、酒石酸、富马酸、柠檬酸，不仅有葡萄酒本来就含有的有机酸，还有人工添加的作防腐剂的酸。

2.2.7 双柱高效液相色谱法 张会宁等［35］用双小柱高效液相色谱法对葡萄及葡萄酒中的有机酸进行了检测，可同时检测8种有机酸。用安捷伦LC 1260液相色谱仪，色谱柱HYPERSIL 150×4.6 mm，5μm，流动相为70 g／L的磷酸氢二钾和14 g／L的硫酸铵定溶至1 000 m L，用硫酸调整p H值至2.1，流速0.8 m L／min，柱温20℃，检测波长210 nm，进样10μL。葡萄酒膜过滤后上机测试，检测时间14 min，各有机酸的相关系数可达0.999 7以上。

3 问题与展望

葡萄酒中有机酸的检测尽管方法很多，但存在检测结果误差大，不同检测方法得到的数据常出现检测出酸的种类不同，不同酸的检测灵敏度不同，导致检测结果相差大的问题。另外，很多检测有机酸的新技术，检测结果一般，但需要配置高端色谱仪和特殊检测器，由于该类设备使用范围过窄，一般实验室没有配备，且操作复杂，需要配备专业的操作人员，因此相关技术很难在一般的实验室使用。

葡萄酒中的有机酸种类和含量，是葡萄酒品质的晴雨表，对研究发酵机理，监控发酵过程具有十分重要的意义。在线检测或高频检测应该具备简便、高灵敏度、高重现性、能检测出主要有机酸的特点。根据已有研究结果，作者认为完善RP－HPLC技术是研究方向，理由之一是现阶段各层次实验室基本都配置了液相色谱仪，其二该类方法能够一次性检测到5～8种主要的有机酸，在现有RP－HPLC技术基础上，研究提高检测灵敏度，扩大检测的线性范围的方法并制定新的检测标准，将为发展葡萄酒产业提供很好的技术支持。

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