丁仁君 夏延斌
DING Ren-junXIA Yan-bin
(湖南农业大学食品科技学院,湖南 长沙 410128)
(College of Food Science and Technology,Hunan Agriculture University,Changsha,Hunan 410128,China)
葡萄酒作为人类较早的酒精饮料之一,有着悠久的历史和文化底蕴。考古发现人类在1万年前的新石器时代就开始采集野生葡萄果实鲜食及酿造葡萄酒[1]。在中国的历史长河中,葡萄酒一直是作为皇宫贵族的饮品,在唐宋鼎盛时期,民间也有自酿自饮葡萄酒的风气。根据中国著名的医典《本草纲目》记述,葡萄酒有“暖肾腰、驻颜色、耐寒”等神奇功效。由此可见,古人对葡萄酒的独到认识和喜爱。
随着科学技术的发展,西方营养学的进步,人们发现了葡萄酒中更多的秘密和独特作用。葡萄酒对人体有益的物质多达上百种,如各种有机酸、酚类、维生素、矿物质等等。虽然有些物质含量不高,但被人体吸收利用率极高。为深入了解葡萄酒的保健功能,科学技术人员还开展了较多的动物和人体试验。发现葡萄酒中的白藜芦醇具有抑制肿瘤[2]、保护心血管[3-5]、抗氧化[6]、清除自由基、预防糖尿病性心肌病[7]等功效;葡 萄 酒 中 的 花 色 苷,具 有 抗 癌[8,9]、降 血 脂[10]、抗氧化[11,12]、抗炎[13]等功效。葡萄酒中的有机酸能反映葡萄原料的特性和酒的风味特性,也能反映酿造工艺的特点,因此近年来相关研究越来越多。
葡萄酒的酿造过程是酵母菌将葡萄中的糖类转化为酒精的过程,整个过程中有多达几十种有机酸参与反应,主要有以下种类。
2,3-二羟基丁二酸,在葡萄果实中大量存在,在成品酒中的含量为1.5~2.5 g/L。酒石酸的酸性很强,最容易解离,所以酒体的p H受酒石酸含量的影响很大。在葡萄酒发酵初期,为抑制杂菌的生长,常常会人为的用葡萄汁将酒石酸溶解,然后加入到发酵容器中,使整体的p H值降低,而促进正常的酒精发酵。在发酵过程中,由于细菌的新陈代谢,酒石酸会被消耗掉一部分,而其他的酒石酸会部分转变成酒石酸盐沉淀[14]。葡萄酒中的酒石酸含量过高时,酒味会变的粗硬,有涩敛感,从而降低葡萄酒的品质[1]。
2 -羟基丁二酸,在自然中有D-、L-、DL-3种存在形式,成品酒中的含量为1.5~3.0 g/L。水果中绝大部分含有L-苹果酸,随着成熟度的提高,其含量会慢慢降低。在葡萄酒酿造时,当酒精发酵基本结束后,会进入苹果酸-乳酸发酵(MLF)阶段,即在乳酸菌的作用下,将L-苹果酸分解为L-乳酸和CO2的过程。对于整个酒体来说,降低了酸涩度,粗糙度和色度等,该发酵过程生成的醛类、酯类等能很好的修饰酒的风味,对于酒的品质形成不可或缺。p H升高的同时,可降低生酒的生青味和苦涩感,能使酒体更柔和、圆润[15]。目前,已经可以通过一些人工的手段对MLF过程进行干扰或调控,以达到理想的葡萄酒风味和稳定性[16]。
2 -羟基丙烷-1,2,3-三羧酸,有温和爽快的酸味,在成品酒中的含量为0.10~0.15 g/L。在各种葡萄果实中均含有柠檬酸,但因酿造工艺不同,不同种类葡萄酒中的柠檬酸含量差别很大。在TCA循环中柠檬酸仅是中间产物,最终被消耗掉。而在苹果酸-乳酸发酵的过程中,乳酸菌在同时分解消耗柠檬酸,产生呈香物质双乙酰(2,3-丁二酮)及其衍生物2,3-丁二醇等,所以红葡萄酒的酿造中几乎耗掉所有的柠檬酸。
2 -羟基丙酸,有D-、L-型两种,成品酒中的含量为0.18~0.40 g/L。乳酸的主要来源是酒精发酵和 MLF发酵,酵母菌发酵产生D-乳酸,MLF发酵形成L-乳酸。乳酸的酸味很强,但酸味较温和。如果酿造过程中未被细菌污染,其在葡萄酒中的含量不会太高。
又名醋酸,具有很强烈的酸味,是酵母菌发酵的常规代谢产物,主要在发酵初期产生,是酒类中主要的挥发酸,在酒体中的含量低于0.4 g/L。乙酸可与乙醇形成酒的特征香味物质——乙酸乙酯。在发酵后期或陈酿过程中,如果未能很好的隔绝氧气或被其他细菌污染,大量乙醇就会转变为乙酸,说明酒体已酸败变质。
即丁二酸,在成品酒中的含量为0.6~1.5 g/L。在酵母菌发酵的过程中,经三羧酸循环均会代谢产生琥珀酸;MLF过程中,苹果酸会转化为琥珀酸;还有一部分来自谷氨酸的转化。琥珀酸的味感复杂,有酸味又有苦味,参与酒味的形成。由于各地的气候、葡萄品种、土壤等差异,导致葡萄原料中的C源、N源含量不同,所以各地区的葡萄酒中琥珀酸含量差别较大。
又名延胡索酸,反丁烯二酸,是柠檬酸三羧酸循环中的中间代谢产物之一,由苹果酸脱去一个水或琥珀酸经脱氢酶作用形成。富马酸的酸味纯正,酸感强,但在葡萄酒中的含量极低,对酒的酸味影响很小。
又叫2-氧代丙酸,是糖酵解过程中,磷酸烯醇丙酮酸在丙酮酸激酶的作用下,生成丙酮酸;丙酮酸在脱羧酶、脱氢酶的作用下,先转变成乙醛,再转变为乙醇。葡萄酒中的丙酮酸含量不高,约为0.05~0.10 g/L[14],大部分被分解,对整体风味无显著的影响。
在乙醛酸循环中,异柠檬酸在裂解酶的作用下生成,还有一部分是由甘氨酸在氧化酶的作用下形成。乙醛酸有不愉快的香味,但在整个发酵中,其仅是中间代谢产物,在最终的葡萄酒中乙醛酸含量极低,故其对整体的风味影响可以忽略。
除此之外,葡萄酒中还有α-酮戊二酸、草酸、莽草酸、糖醛酸、葡萄糖酮酸、半乳糖二酸等多种有机酸,这些酸在葡萄酒中的含量微乎其微,对酒的风味影响不大。
随着色谱技术的成熟和推广,食品中有机酸的测定技术得到了快速发展。GB/T 15038-2006[17]葡萄酒、果酒通用分析方法中规定了HPLC法测定有机酸的方法,尽管该标准仅发布几年,但其方法的局限性很明显,如,前处理中要进行固相萃取柱的活化、洗脱并收集样品,才能进行测定,甚为繁琐。学者们更希望有简便、快速的检测方法,所以在国标的基础上,对前处理方法、检测条件等进行优化,获得了一些较好的成果。
液相色谱检测葡萄酒中的有机酸占利用色谱技术检测有机酸的70%以上,准确率、重复性、便捷性均优于其他检测方法。表1是液相色谱法检测有机酸的方法比较。
根据表1所列方法,可以归纳出RP-HPLC法检测葡萄酒中有机酸的要点:流动相需经0.45μm滤膜过滤脱气后方可使用;经发酵、陈酿后,大部分有机酸已经转移到酒体中,故样品经离心或不离心,稀释定容后过0.45μm微膜,方可上机检测。色谱条件:配VWD检测器,ODS或性能相当的色谱柱,250×4.6 mm,5μm,检测波长210 nm,柱温25~30℃,流速0.6~0.8 mL/min,进样5或10μL(视机器而定),以0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液,p H 2.7~3.0的 K2HPO4或(NH4)2HPO4溶液作流动相进行检测,在这些基本条件下各种酸的分离度、相关系数、回收率都较高。如胡小露等[25]进行9种有机酸的精密度试验,平均RSD可达0.15%(n=6);进行重复性试验,平均RSD可达0.35%(n=6);加标回收率试验,平均回收率为99.52%,平均 RSD为0.019%(n=5);发酵结束后,每隔10 d连续取样4次进行测定,也未出现杂峰对目标物质的干扰。其他学者的回收率也都较高,由此可见,RP-HPLC法测葡萄酒中的有机酸,安全、快速、可靠,而且操作简便,是检测有机酸的首推方法。
2.2.1 衍生化气相色谱法 气相色谱使用成本较低,且对环境相对友好。杜曦等[27]通过酯化方法的比较,筛选出碘乙烷衍生化处理方法,用福力GC9790气相色谱仪,SP-30毛细管柱,程序升温法,同时测定了葡萄酒中的丙二酸、琥珀酸、苹果酸、戊二酸、酒石酸、己二酸、柠檬酸,分析时间16 min。各种酸的分离度很好,且回收率可达95.1%~98.9%。
表1 不同的液相色谱方法检测葡萄酒中的有机酸Table 1 Different method for organic acids testing in wine
表1 不同的液相色谱方法检测葡萄酒中的有机酸Table 1 Different method for organic acids testing in wine
T.酒石酸;M.苹果酸;L.乳酸;A.乙酸;C.柠檬酸;F.富马酸;S.琥珀酸;O.草酸;As.抗坏血酸;I.异柠檬酸;Sh.莽草酸;-.未提及。
文献样品前处理色谱仪 柱子型号 流动相流速/(m L·min-1)柱温/℃检测波长/nm酸的种类分析时间/min进样量/μL GB/T 15038 过固相萃取柱 -Fetigsaule T 300-7,8 0.007 5 mol/L H 2 SO4溶液0.3 55 210 T,M,L,A,C,S- 20[18]皂土处理,活性炭吸附后,微膜过滤Waters 600E Bio-Rad HP×87-H,300×7.5 mm,9μm 0.1%磷酸水溶液 0.7 55 192 C,T,M,S,L,A- 5[19] 离心后微膜过滤岛津LC-3A SCR-101H300×7.9 mm高氯酸调的p H 2.5 H 2 O溶液0.6 55 210 C,T,M,S,L,A 16 10[20] 直接微膜过滤日立638-50 Hypersil 250×4.0 mm,10μm p H 2.75 0.01 mol/L(NH 4)2 HPO4 0.6 25 210 T,M,L,C,S 14 15[21] 微膜过滤两次Waters 600E Shodex Rspak Kc-811 0.1%磷酸水溶液 0.5 65 206 C,T,M,S,L,A 16 5[22] 离心后微膜过滤 岛津VP-ODS C18,150×4.6 mm p H 3.0 0.01 mol/L H 3 PO4-KH 2 PO4 1.0 30 215 T,M,C,S 6 -[23]将葡萄破碎后加水超声提取、稀释,再微膜过滤福立FL2200ⅡUltimate XB-C18,250×4.6 mm,5μm p H 2.0 0.01 mol/L K2 HPO4,K2 HPO4∶CH 3 OH=97∶3 0.5 25 210 T,M,As,L,A,C 19 20[24] 水浴震荡、离 心后,微膜过滤[25] 直接微膜过滤Agilent 1200 Waters 600 Kromasil C18,250×4.6 mm,5μm Waters symmetry C18,250×4.6 mm,5μm p H 2.8 0.01 mol/L KH 2 PO4,KH 2 PO4∶CH 3 OH=97∶3 p H 2.0 4 g/100 m L(NH 4)2 HPO4 0.8 25 210 1.0 室温 210 O,T,M,As,C O,T,M,I,Sh,L,A,C,S 8 10 11 5[26] 离心后直接微膜过滤Agilent 1200 Ultimate TM AQ-C18 250×4.5 mm,4.5μm p H 2.85 0.01 mol/L(NH 4)2 HPO 4 0.8 30 210 T,M,L,A,C,F,S 15 10
2.2.2 单柱离子排斥色谱法 离子排斥色谱是离子色谱法的一个重要分支,是分离有机酸的常用方法。徐继明[28]用岛津LC-10AS离子色谱仪,CDD-6A 电导检测器,TSKgel OApak-A色谱柱,p H 3.4 2 mmol/L苯甲酸溶液作流动相,流速1.0 m L/min,进样25μL,电导检测器1μS/cm,柱温25℃±2℃,分析时间14 min,可同时对葡萄酒中的酒石酸、柠檬酸、苹果酸、甲酸、乙酸、琥珀酸进行测定。分离时间较短,相对偏差为1.8%~3.6%,回收率为97.9%~105.6%。
2.2.3 HPLC-PDA 法 Yan-jun Zheng等[29]直接将葡萄原汁或葡萄酒离心,稀释后直接经0.22μm滤膜过滤,用液相色谱二极管阵列检测法(HPLC-PDA)进行检测,可同时测定草酸、酒石酸、丙酮酸、L-苹果酸、L-抗坏血酸、L-乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸9种有机酸。色谱条件为Waters系列色谱仪,Waters-2695XE四元泵,Waters-2996 PDA 检测器,Waters Atlantis dC18色谱柱(150×4.6 mm,5μm),流速1.0 m L/min,进样10μL,检测波长为抗坏血酸243 nm,其他酸210 nm,柱温30℃,p H 2.7的0.01 mol/L KH2PO4∶乙腈=95∶5,检测时间小于13 min,可使大部分有机酸得到良好分离。
杨东伟等[30]用固相萃取-高效液相色谱-光电二极管阵列检测法(SPE-HPLC-PDA),同时对葡萄酒中的11种有机酸进行检测,分别为草酸、乙酸、丙烯酸、琥珀酸、丙二酸、酒石酸、富马酸、柠檬酸、丙酸、苹果酸、乳酸。用Agilent 1100液相色谱仪,配二极管阵列检测器,Hypersil C18色谱柱(250×4.6 mm,5μm),流速1.0 m L/min,进样20μL,检测波长210 nm,柱温25℃,甲醇和0.5%磷酸水溶液作流动相,用梯度洗脱法,分析时间15 min。该法分析时间较短,且同时检测的有机酸种类多,分离度好。
2.2.4 RP-HPLC-CL法 吴永平等[31]用液相色谱-化学发光分析方法(RP-HPLC-CL)对葡萄酒中的苹果酸、柠檬酸、琥珀酸3种有机酸进行了分析。用葡萄酒用滤纸过滤后稀释,再微膜过滤即可进行检测。色谱条件:岛津LC-6A液相色谱仪,k BPCL超微弱发光测量仪,依利特Hypersil ODS 25μm,4.6×150 mm,流动相为p H 2.5的 HClO4溶液,流速0.8 m L/min,进样20μL,柱温为室温。分析时间仅8 min,但只能检测3种有机酸。
2.2.5 液相指纹图谱法 指纹图谱技术是近十几年来一种发展快速的对复杂物质的研究方法,已广泛应用于中草药等天然产物鉴定及其质量控制中。葡萄酒有天然属性,但有类似中药的复杂体系,故用此方法可提供丰富的鉴别信息。辛若竹等[32]用液相色谱建立有机酸指纹图谱,即用山葡萄酒建立指纹图谱库,有15个特征峰,对应15种有机酸,再将样品与指纹图谱进行对比,以确认是否为人工勾兑葡萄酒。用岛津LC 20AT液相色谱仪,Shimpack VP-ODS 色谱柱(250×4.6 mm,5μm),p H 2.9 0.02 mol/L KH2PO4溶液,KH2PO4∶CH3OH=98∶2,流速1.0 m L/min,进样20μL,检测波长210 nm,柱温30℃,分析时间60 min。此法可很好的用来鉴别葡萄酒的真伪及原汁含量。
2.2.6 离子色谱法 离子色谱-电导检测法,是种新型的检测手段,电导检测器可以分析混合物中的常量、痕量阴阳离子。李 芳 等[33]用 Dionex ICS-2000 离 子 色 谱 仪,4 mm AS11-HC分离柱,2~40 mmol/L NaOH 溶液作梯度洗脱液,淋洗流速1.0 m L/min,进样25μL,同时对葡萄酒中的乳酸、丙酸、丁酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸6种有机酸进行了检测,分析时间33 min。
张斯等[34]用 Dionex ICS-1500离子色谱仪,IonPac AS11(250×4 mm)分析柱,0.2~25 mmol/L KOH 溶液作梯度洗脱液,淋洗流速1.0 m L/min,进样25μL,色谱池温度35℃,柱温30℃,控制电流100 m A,对进口葡萄中的9种有机酸同时进行了检测,分别为乳酸、乙酸、丙烯酸、山梨酸、苯甲酸、苹果酸、酒石酸、富马酸、柠檬酸,不仅有葡萄酒本来就含有的有机酸,还有人工添加的作防腐剂的酸。
2.2.7 双柱高效液相色谱法 张会宁等[35]用双小柱高效液相色谱法对葡萄及葡萄酒中的有机酸进行了检测,可同时检测8种有机酸。用安捷伦LC 1260液相色谱仪,色谱柱HYPERSIL 150×4.6 mm,5μm,流动相为70 g/L的磷酸氢二钾和14 g/L的硫酸铵定溶至1 000 m L,用硫酸调整p H值至2.1,流速0.8 m L/min,柱温20℃,检测波长210 nm,进样10μL。葡萄酒膜过滤后上机测试,检测时间14 min,各有机酸的相关系数可达0.999 7以上。
葡萄酒中有机酸的检测尽管方法很多,但存在检测结果误差大,不同检测方法得到的数据常出现检测出酸的种类不同,不同酸的检测灵敏度不同,导致检测结果相差大的问题。另外,很多检测有机酸的新技术,检测结果一般,但需要配置高端色谱仪和特殊检测器,由于该类设备使用范围过窄,一般实验室没有配备,且操作复杂,需要配备专业的操作人员,因此相关技术很难在一般的实验室使用。
葡萄酒中的有机酸种类和含量,是葡萄酒品质的晴雨表,对研究发酵机理,监控发酵过程具有十分重要的意义。在线检测或高频检测应该具备简便、高灵敏度、高重现性、能检测出主要有机酸的特点。根据已有研究结果,作者认为完善RP-HPLC技术是研究方向,理由之一是现阶段各层次实验室基本都配置了液相色谱仪,其二该类方法能够一次性检测到5~8种主要的有机酸,在现有RP-HPLC技术基础上,研究提高检测灵敏度,扩大检测的线性范围的方法并制定新的检测标准,将为发展葡萄酒产业提供很好的技术支持。
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