无溶剂体系脂肪酶动力学拆分2-辛醇及产物的非均相共沸蒸馏提取

任立伟，徐 田，蒋振华，贾红华，周 华，韦 萍

(南京工业大学 生物与制药工程学院，南京 211800)

手性仲醇是合成药物和其他精细化学品重要的手性辅剂。例如，S-和R-2-辛醇均为合成农药，医药化学品和高质量液晶等高附加值产品的重要中间体［1－3］。与不对称合成和化学拆分法制备光学纯仲醇相比，酶动力学拆分法具有立体选择性高、反应条件温和、副产物少和生产成本较低等优势［4］。特别是脂肪酶能够在非水相中催化非天然底物之间反应的特性，使其成为动力学拆分手性仲醇的首选酶制剂，并且相关研究也已得到了很好的发展［5－7］。

脂肪酶拆分手性仲醇通常在疏水性有机溶剂中进行，近年来离子液体和超临界流体等新兴的非水相酶催化溶剂的使用为解决工业酶催化的问题提供了新的可能［8－9］。然而，这两种新型溶剂的制备和使用成本依然较高，并且仍未从根本上解决有溶剂催化体系存在的弊端。无溶剂酶催化体系无论从催化效率、产物提取以及过程绿色化等角度都具有有溶剂体系所无可比拟的优势［5，10］。但是，目前基于无溶剂体系的酶动力学拆分手性仲醇的研究相对较少。非水相酶催化反应并非在完全无水的条件下进行，酶表面须结合微量的“必需水”以使酶分子具有一定的柔性，从而满足酶催化过程中酶构象变化的要求［11］。然而，过量的水分不仅会影响酶在非水相中的活性和稳定性，还可能会导致副反应发生。因此，非水相中的水含量对催化效果具有十分重要的影响。

目前，从无溶剂反应体系中提取光学纯仲醇主要通过硅胶层析或高效液相色谱分离法［12－13］。但是，层析分离过程中需要将待分离组分溶于流动相，并且分离得到的产物一般存在于洗脱液。而上述流动相或者洗脱液一般为几种有机溶剂的混合物，这些溶剂的使用在一定程度上将使前期的无溶剂反应失去意义。

在本文中，笔者将以2-辛醇为模式底物，努力建立一个简单、高效的无溶剂脂肪酶催化拆分手性仲醇反应体系，并将对无溶剂体系中微量水对拆分效果的影响进行分析以及尝试利用脂肪族仲醇与水形成低沸点共沸物的特性，在常压条件下通过非均相共沸蒸馏的方法对拆分得到的光学纯手性仲醇进行提取分离。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

脂肪酶Novozyme 435(Candida antarctica Lipase B吸附固定化于大孔树脂)，诺维信公司;4A分子筛和正己烷(HPLC级)，上海国药试剂;辛酸乙烯酯(AR)，上海紫一试剂;2-辛醇(AR)，日本 TCI试剂公司;其他试剂均购于美国Sigma-Aldrich公司。所有试剂在使用前用4A分子筛除水1周以上。实验所用水均为去离子水。酰基供体的logP值经Chemdraw Ultra 7.0软件计算得到。

1.2 脂肪酶催化2-辛醇动力学拆分反应

将外消旋2-辛醇(36 mmol)，酰基供体(18～90 mmol)和4A分子筛(6.0 g)加入到25 mL具塞三角瓶中，并置于45℃摇床中充分混匀。向反应瓶加入0.18 g脂肪酶Novozyme 435后反应开始计时，间隔一定时间取样15 μL，用0.5 mL正己烷稀释，再经0.22 μm有机系膜过滤后，进气相检测。当反应以辛酸乙酯为酰基供体时，无需添加分子筛，但需在5 mm Hg的真空环境下进行反应。当反应以辛酸乙烯酯等活性酯类为酰基供体时，无需去除副产物。

1.3 脂肪酶的操作稳定性检测

当2-辛醇的转化率达到50% 时，终止拆分反应。用砂芯漏斗过滤回收固定化酶和4A分子筛，并收集滤液用于提取拆分得到的手性仲醇。用适量的正己烷冲洗固定化酶，在常温常压下风干30 min后，加入到组成与前一批相同的新鲜反应液中，在相同的条件下再次催化拆分反应，并对结果进行检测。以相同的方法重复数次上述操作。

1.4 非均相共沸蒸馏提取拆分得到的光学纯2-辛醇

在实验室小试阶段，采用普通的玻璃蒸馏装置进行非均相共沸蒸馏操作。反应液(过滤除固定化酶和分子筛后)与一定量的水加入到50 mL圆底烧瓶中，充分搅拌，将蒸汽出口处的温度加热到98.0℃。当蒸汽经过冷凝管后，凝结成的液体自动分为光学纯2-辛醇和水上下两层。无需其他任何处理，上层有机物即为所要产物。

1.5 气相色谱检测方法

采用Agilent 6890型气相色谱仪(美国安捷伦公司)对试样的光学纯度和提取得到的光学纯2-辛醇的组成进行检测分析。测定底物2-辛醇的对映体过量率(e.e.s)时，试样需要首先与过量的衍生化试剂R-苯乙基异氰酸酯在45.0℃反应45 min后方可进气相色谱仪检测［14］。色谱柱为 Agilent DB-1(30 m ×0.25 mm ×0.25 μm)，柱室温度为110.0 ℃维持1 min，以15℃/min升温至210℃并维持1 min，再以1℃/min升温至225℃并维持1 min。其中，tr(S)=12.4 min，tr(R)=13.1 min。测定反应生成的2-辛醇相应的酯类物质的对映体过量率(e.e.p)时，可直接利用手性气相色谱柱检测。色谱柱为Varian CP-chirasil-Dex CB(25 m×0.25 mm×0.25 μm)，柱室温度为60℃ 维持1 min，以3℃/min升温至200℃并维持1 min。

对映体过量率 e.e.=(A1－A2)/(A1+A2)×100%，其中:A1和A2分别为气相检测时2种对映异构体中较大的峰面积和较小的峰面积。对映体比率 E=ln［(1 － e.e.s)/(1+e.e.s/.e.e.p)］/ln［(1+e.e.s)/(1+e.e.s/e.e.p)］;底物转化率 C=e.e.s/(e.e.s+e.e.p)×100% 。

蒸馏得到的光学纯2-辛醇用正己烷稀释后，同样用气相色谱法对其组成进行分析，并计算其纯度。色谱柱为Agilent DB-225(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，柱室温度为 60℃ 维持 1 min，以 10℃/min升温至210℃并维持1 min。

1.6 无溶剂体系含水量检测方法

采用SFY-3000型全自动微量水分测定仪(淄博博山海分仪器厂)检测反应过程无溶剂反应液中含水量的变化。反应过程中，间隔一定时间用50 μL微量进样器吸取反应液，直接进微量水分测定仪检测。采用SC69-02C型烘干法水分测定仪(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)检测反应前后脂肪酶固体中含水量的变化。未经使用的Novozyme 435和反应后过滤回收得到的Novozyme 435，均用无水正己烷冲洗过滤数次，常温常压下风干30 min后再进行检测。

2 结果与讨论

2.1 酰基供体种类对拆分效果的影响

无溶剂反应体系中，底物同时起到反应溶剂的作用，在醇类物质确定的前提下，酰基供体的种类相比于有溶剂反应体系时对脂肪酶催化拆分效果的影响将更为显著，所以首先对其进行考察，结果见表1。由表1可知，即使使用疏水性相对较强的辛酸乙烯酯(log P=3.28)为酰基供体，拆分效果也很不理想，说明无溶剂体系不适合采用活性酯为酰基供体。辛酸乙酯(log P=3.03)曾被认为是较为理想的无溶剂体系拆分手性仲醇的酰基供体，但其副产物乙醇只能通过抽真空的方法去除，这将极大的增加对生产设备的要求和能量的消耗。

因此，可以推断以中长链脂肪酸为酰基供体的拆分效果最好，因此选择几种常用的脂肪酸进一步比较研究，结果见表2。由表2可知:己酸需要更长的反应时间以达到近似50%的转化率，但S-2-辛醇的e.e.值仍不到90%，可能对于脂肪酶而言，己酸(log P=1.91)的疏水性依然不足且酸性仍较强。癸酸(log P=3.27)和月桂酸(log P=4.10)在室温下均为固体，45℃熔融后反应体系黏度较大，不易于物质和能量的传递。辛酸(log P=2.43)的疏水性虽然比它们稍弱，但以其为酰基供体时反应体系较低的黏度可弥补疏水性的不足。综合以上结果，在以下的研究中选择辛酸为酰基供体。

表1 不同种类的酰基供体对2-辛醇的拆分效果Table 1 Kinetics resolution of 2-octanol with different kinds of acyl donors

表2 以不同中长链脂肪酸为酰基供体对2-辛醇的拆分效果Table 2 Kinetics resolution of 2-octanol with different middle-chain fatty acids

2.2 反应温度和底物摩尔比对拆分效果的影响

在辛酸与2-辛醇的摩尔比为0.5∶1～2∶1和反应温度为30～60℃的范围内，考察上述两因素对无溶剂体系脂肪酶拆分2-辛醇效果的影响，结果见表3。由表3可知:以拆分反应达到50%左右的转化率为目标时，升高反应温度可缩短反应时间。在此无溶剂体系中，在60℃的高温条件下Novozyme 435依然保持了较高的活性，但是脂肪酶对底物的选择性却明显降低。而在30℃时反应体系较高的黏度会增加固定化脂肪酶催化拆分反应时的物质和能量的传递阻力。结果表明，45℃的反应温度最为理想。以0.5∶1的条件进行拆分时，若反应的转化率能达到50%，体系将只剩为拆分得到的S-2-辛醇和生成的相应的R型酯，这将极大的便于产物的分离提取。遗憾的是，即使反应生成的副产物水及时被分子筛去除，此条件下转化率也未能达到50%。由此说明，过量的酰基供体因其既作为反应溶剂又推动反应向酯化方向进行为无溶剂体系所必需。同时，辛酸过多则不利于后期对S-2-辛醇进行提取，在保证目标物较高的光学纯度的前提下，将最适宜的底物摩尔比确定为1.5∶1。

表3 其他反应条件对酶催化动力学拆分2-辛醇效果的影响Table 3 Effects of reaction conditions on enzymatic kinetics resolution of 2-octanol

2.3 无溶剂体系中水分对拆分效果的影响

在优化后反应条件下，对拆分过程中反应液和催化拆分前后固定化酶的含水量变化进行了考察，结果见图1。由图1可知:反应开始的4 h内，反应速率较快，副产物水在反应液中的含量也随之增加。当反应时间大于4 h，由于可被催化的底物的浓度降低，反应速率开始减慢，进而单位时间内水生成量也开始降低。而分子筛吸水速率基本恒定，所以反应液中的含水量开始呈下降趋势，并且在此阶段正是分子筛稳定的去除副产物水的能力推动速率已经开始减慢的拆分反应向正方向不断进行。整个拆分反应过程中，无溶剂反应液的含水量虽然发生了波动，但被很好地控制在0.6%以下。反应结束后，固定化酶Novozyme 435的含水量也维持在反应前的2%左右。由此证明，分子筛只去除与之接触的反应液中生成的副产物水，而不会剥夺脂肪酶催化所必需的结合水，这对非水相脂肪酶催化的不对称酯化反应是十分有利的。

图1 酶催化拆分2-辛醇反应过程Fig.1 Process of the enzymatic resolution of 2-octanol

2.4 脂肪酶在无溶剂体系中的操作稳定性

当反应的转化率达到50%后，过滤回收固定化脂肪酶Novozyme 435，并收集反应液用于提取拆分的得到的S-2-辛醇。Novozyme 435只需经正己烷洗涤，并在常温常压下风干30 min后就可以加入到新的反应液中重复利用以考察脂肪酶的操作稳定性，结果见图2。由图2可知:Novozyme 435经6次连续使用后，反应的转化率依然维持在48%以上，S-2-辛醇的e.e.值也只是略有降低，并且将反应时间由12 h延长到14 h后，又可恢复到 e.e.s＞98%，与第一次拆分反应相近的水平。在无溶剂体系中，虽然底物酸和醇的浓度均较高，但是经过优化后，反应条件较为温和，体系的疏水性适宜，特别是对反应体系中副产物水的控制且未剥夺脂肪酶结合的“必需水”，因此固定化脂肪酶在此反应体系中具有良好的操作稳定性。

图2 脂肪酶在无溶剂体系中的操作稳定性Fig.2 Reusability of lipase in solvent-free system

2.5 非均相共沸蒸馏提取拆分得到的S-2-辛醇

回收固定化酶后反应液由拆分得到的S-2-辛醇、剩余的辛酸和生成的R型酯组成，其中只有2-辛醇可以与水形成低沸点共沸物(2-辛醇(27.0%)、水(73.0%)，98.0 ℃)［15］，更重要的是，2-辛醇与水不互溶，蒸出液经冷却后可自动分层，无需进一步分离。研究中以水为夹带剂在常压下对拆分得到的S-2-辛醇进行非均相共沸蒸馏提取，结果见表4。

由表4可知:当根据共沸物的组成，将适量的水加入到反应液中进行共沸蒸馏提取时，虽然蒸出液中S-2-辛醇的 e.e.值保持不变，但只有 S-2-辛醇总量的75.6%被蒸出，所加入的水与疏水性的S-2-辛醇充分接触可能是成功提取的关键。因此，曾尝试在超声乳化下进行共沸蒸馏提取，但S-2-辛醇的蒸出率反而降低，这可能是因为水与整个反应液均发生了乳化，而与非S-2-辛醇组分之间的乳化相当于对水的消耗。转而采用了加速搅拌和提高水添加量的方法进行提取。当水添加量为理论需水量2倍时，所有拆分得到的S-2-辛醇均被成功的提取出，并且产品的纯度进一步增加到98%以上。并且因为2-辛醇不溶于水，不会有S-2-辛醇残留在蒸出液中的水层，总产率也已达到90%以上。研究中发现，反应液为淡黄色，而蒸出的S-2-辛醇为无色液体，所以共沸蒸馏的过程还同时完成了对产品的脱色处理。

表4 加水量对S-2-辛醇蒸馏效果的影响Table 4 Effects of the amount of added water on distillation of S-2-octanol

3 结论

首先对酰基供体的种类进行选择并对反应条件进行优化，发现活性酯类因其产生大量乙醛并不适用于无溶剂酶催化体系。与辛酸乙酯等脂肪酸简单酯类相比，脂肪酶的天然底物中长链脂肪酸更适合作为无溶剂脂肪酶动力学拆分手性仲醇的酰基供体。针对脂肪酸的特性，选择添加分子筛的方法去除副产物水。研究中发现，无溶剂反应中含水量随反应的进行发生了波动，但总体被控制在0.6%以下。通过测定反应前后Novozyme 435含水量的变化证明，分子筛并不会破坏脂肪酶的结合水。反应结束后，向反应液中加入适量的水，通过非均相共沸蒸馏的方法提取拆分得到的S-2-辛醇。S-2-辛醇的光学纯度并未降低，且产率和纯度分别大于90%和98%。此拆分及提取过程具有操作简单，酶催化效率高，过程绿色，成本及能耗低，产率及产品纯度高等特征。

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