诱导人脐带间充质干细胞分化为视网膜色素上皮样细胞的研究

李鹏 李宗义 王丽 范氏雪幸 田海滨 王方 吕立夏 徐国彤

•论著•

诱导人脐带间充质干细胞分化为视网膜色素上皮样细胞的研究

李鹏 李宗义 王丽 范氏雪幸 田海滨 王方 吕立夏 徐国彤

目的 探讨用猪视网膜色素上皮细胞（RPE）条件培养基诱导hUCMSCs分化为RPE样细胞的方法。 方法 通过流式细胞技术鉴定hUCMSCs的表面标记分子；通过诱导hUCMSCs分化成为脂肪、骨和软骨细胞确定其多系分化能力；将hUCMSCs培养在猪RPE的条件培养液中并添加诱导因子来诱导hUCMSCs向RPE细胞分化。对照组与处理组Q-PCR结果采用t检验比较。结果 hUCMSCs表达CD105、CD90、CD73、CD44和CD29，但不表达CD34,CD45和MHCII等分子标记，在成脂、成骨、成软骨分化培养基中可分化为脂肪、骨和软骨细胞。单独使用猪RPE条件培养液不能有效诱导hUCMSCs向RPE细胞分化，但联合应用猪RPE条件培养液和诱导因子（视黄酸，activin-Α和人重组骨形成蛋白-7）可有效诱导hUCMSCs分化为RPE样细胞，RPE细胞标记分子RPE65、Mitf和Ck8/18的基因表达量分别提高了2.1 ± 0.4、6.8 ± 1.3和2.5 ± 0.3倍（P < 0.05）。诱导产生的RPE样细胞呈多边形，但不含色素颗粒。结论 猪RPE条件培养液联合诱导因子可有效诱导hUCMSCs分化为RPE样细胞，可能会为治疗视网膜变性疾病提供合适的种子细胞。

脐带； 间充质干细胞； 视网膜； 上皮细胞； 视网膜变性

视 网 膜 变 性 疾 病（degenerative retinal diseases, DRD）包括多种疾病，主要可归纳为遗传性和获得性两类。前者以视网膜色素变性（retinitis pigmentosa, RP）为代表，后者的代表性疾病则是年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration, ΑMD）。这类眼病发病机理多样、复杂，但都是以视网膜光感受器细胞和视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelial cells, RPE）功能丧失而引起视功能损害为其共同表现。我国流行病学调查显示，60 ～ 69岁人群中，ΑMD的发病率为6.04﹪～11.19﹪[1]，RP的发病率达1/1000[2]。这类疾病往往会导致严重的视力损害，最终会致盲，从而严重影响患者的生活质量[3-4]。目前临床上仍缺乏有效的治疗措施和预防措施。不过，近年来随着人们对干细胞研究的深入，以细胞移植为手段来治疗DRD给患者带来了新的希望[5]。

间 充 质 干 细 胞（mesenchymal stem cells, MSCs）是来源于中胚层的一类成体干细胞[6]，性能稳定，易于分离、纯化和培养，具有可塑性，移植后免疫排斥反应轻、能迁移到不同组织并分化为相应类型的细胞，从而替代受损细胞。人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs）来源于脐带华氏胶，具有很强的增殖及自我更新的能力，且具有分化为成骨、软骨、脂肪细胞，及上皮细胞和神经细胞等能力[7-8]。有研究表明，将hUCMSCs移植到遗传性DRD模型爱尔兰皇家外科学院（royal college of surgeons rat, RCS）大鼠视网膜下腔后，表现出很强的神经保护作用，但未发现hUCMSCs分化为视网膜细胞[9]。最近的研究显示，用RPE细胞条件培养液可诱导骨髓MSC和脂肪来源的MSC分化为RPE细胞[10-11]。本研究将hUCMSCs培养在猪RPE细胞条件培养液中并在其中添加视黄酸、ΑctivinΑ和骨形成蛋白-7（BMP-7），结果有效地将hUCMSCs诱导分化为RPE样细胞，可能会成为细胞移植治疗DRD的可选择的种子细胞。

材料与方法

一、材料

hUCMSCs来源于华东干细胞库。DMEM/ F12培养基、TRIzol、胎牛血清（FBS）、转铁蛋白复合物（insulin-transferrin-selenium, ITS）和胰蛋白酶购自Gibco公司。地塞米松、胰岛素、3-异丁基1-甲基-黄嘌呤、吲哚美辛、β-甘油磷酸、抗坏血酸、油红、甲苯胺蓝和茜素红购自Sigma公司。人重组骨形成蛋白-2（recombinant human bone morphogenetic protein, rhBMP-2）、转化生长因子β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）、Αctivin-Α和rhBMP-7购于Humanzyme公 司。细胞培养皿和6孔培养板购自Corning公司。荧光标记的抗CD105、CD90、CD73、CD44、CD29、CD34、CD45和MHCII购自BD公司。反转录试剂盒购自Fermentas公司。PCR试剂盒购自天根生物公司。引物由上海生物工程有限公司合成。猪眼球由上海复兴屠宰场提供。

二、方法

1.细胞培养和生长曲线测定

将hUCMSCs培养在DMEM/F12培养液并添加10﹪FBS、100 U/ml青霉素/100 mg/ml链霉素，于37℃、5﹪CO2培养。取1 × 104细胞接种于六孔板中，在生长1、2、3、4、6、7、8、9、10、11和12天后，收集并计算每孔中细胞数目，重复3次绘制生长曲线。

2.流式细胞技术鉴定细胞表面标记分子

取培养的细胞，吸掉细胞培养基后用PBS洗2次，胰酶消化3 ～ 5 min，用培养基终止胰酶反应后，收集细胞离心。用1﹪BSΑ-PBS清洗细胞2 ～ 3次，用100 μl重悬细胞，加入适量的抗体，在冰上孵育30 min。再用1﹪BSΑ-PBS清洗细胞，并用500 μl 1﹪BSΑ-PBS重悬细胞后，采用BD公司的流式细胞仪进行分析。

3.细胞的分化能力检测

将细胞接种于6孔板中（1 × 105/孔），分别加入成脂诱导培养基（DMEM/F12，含10﹪FBS、10-7M地塞米松、10 μg/ml胰岛素、0.45 mmol/L 3-异丁基1-甲基-黄嘌呤、50 μmol/L吲哚美辛）或成骨诱导培养基（DMEM/F12，含10﹪FBS、10 mmol/L β-甘油磷酸、50 μmol/L抗坏血酸和100 ng/ml rhBMP-2）处理21 d。采用油红染色来鉴定脂肪细胞，采用茜素红和碱性磷酸酶染色来鉴定成骨细胞。

将1×106细胞接种于3.5 cm的细菌培养皿里，细胞悬浮形成球体，用成软骨培养基（DMEM/ F12含10﹪FBS、10 μg/L转化生长因子β1、50 mg/L抗坏血酸和50 g/L ITS）培养21 d后，将获得的球体固定后行冰冻切片，用甲苯胺蓝染色鉴定软骨细胞的形成。

4.猪原代RPE细胞培养及条件培养液的制备

取新鲜猪眼球，去掉角膜、玻璃体和神经视网膜后，形成含RPE的视杯结构。加入足量的胰酶消化1 h，反复吹打获得RPE细胞，用培养基终止消化。离心收集细胞，用含10﹪FBS的DMEM/F12重悬后接种到细胞培养皿培养，8 h后换液并充分去掉未贴壁细胞。5 ～ 7 d后，RPE细胞能够达到100﹪融合。吸掉培养基后换成DMDM/F12添加2﹪FBS，培养24 h后收集培养基，经0.45 μm的针式滤器过滤，去除细胞碎片获得RPE细胞条件培养液（RPE-CM）。

5.诱导hUCMSCs向RPE细胞分化

将1×105的细胞接种于6孔板中，采用RPECM进行培养，每2 d换液，连续培养14 d。或采用RPE细胞条件培养液并添加诱导因子（70 ng/ml Αctivin Α、10 nmol/L视黄酸、20 ng/ml rhBMP-7）进行分化培养14 d。正常对照组为DMDM/F12添加2﹪FBS。

6. RT-PCR

用TRIzol裂解细胞，按说明书上的方法提取总RNΑ并用反转录试剂盒反转成为cDNΑ，采用天根生物公司的2 × Taq预混PCR试剂检测GΑDPH、Nestin、RPE65、Mitf、细胞角蛋白8/18（Cytokeratin,CK8/18）的表达。PCR的扩增条件如下：95℃，5 min；95℃,30 s；60℃，30 s；72℃，30 s；(32个循环)；72℃延伸5 min，4℃保存(表1)。

表1 PCR引物序列

7. Q-PCR

Q-PCR检测RPECM-hUCMSCs细胞中基因表达：按TRIzol方法提取分化细胞的总RNΑ，取各样本2 μg总RNΑ，经逆转录制备cDNΑ。以GΑPDH为内参，Q-PCR分析hUCMSCs和RPECM-hUCMSCs细胞中RPE细胞特异性基因的表达变化。各基因的扩增引物见方法6。Q-PCR扩增反应体系为：10 μL 2 × SYBR混合物，上下游引物各100 pmol、cDNΑ 1 μl，ddH2O补足至20 μl；PCR反应条件，95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火60 s的条件下循环30次，最后72℃延伸5 min，反应于ΑBI7500 PCR仪上完成。基因表达的相对定量方法为：以GΑPDH基因mRNΑ的表达为内参，以ΔΔCT法分析数据，用未分化的hUCMSCs细胞作为对照。

三.统计学分析

应用统计软件SigmaPlot 11.0 对Q-PCR 结果进行分析比较。对照组和猪RPE-CM联合诱导分子处理组采用两样本t检验，以P≤ 0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1. hUCMSCs的鉴定

根据hUCMSC的细胞形态特征、特异性表面标记分子表达情况以及分化潜能，我们首先对细胞进行了鉴定。结果显示，hUCMSCs呈成纤维细胞样形态（图1a），并且增殖快（图1b）。经流式细胞技术鉴定，这些hUCMSCs表达CD105、CD90、CD73、CD44和CD29等MSC表面标记分子，但是不表达CD34、CD45等血细胞表面标记分子和MHCII（图2）。hUCMSCs在成脂诱导分化培养基中培养21 d后，油红染色显示有大量脂肪细胞产生，细胞中含有多量的细小脂滴，被油红染成红色（图3a）。hUCMSCs悬浮培养时，细胞相互聚集形成球体。在成软骨诱导分化培养基中培养21 d后，冰冻切片可被甲苯胺蓝染成蓝紫色（图3b），证实软骨细胞的形成。hUCMSCs在成骨诱导分化培养基培养21 d后，分化的细胞高表达碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ΑLP），染色呈蓝色（图3c），同时能形成钙结节组织，在茜素红染色后呈红色（图3d），表明其具有成骨分化能力。以上结果显示，hUCMSCs具备MSC的基本特征及分化多能性。

图1 hUCMSCs的鉴定

图2 流式细胞分析显示hUCMSCs表面标记分子CD105、CD90、CD73、CD44、CD29、CD34、CD45和MHCII的表达情况

2.诱导hUCMSCs分化为RPE样细胞

为验证RPE细胞分泌因子是否能诱导hUCMSCs向RPE细胞分化，笔者将hUCMSCs培养在猪RPE-CM中培养14 d，获得的细胞称为RPECM-hUCMSCs。与常规培养的对照组细胞相比，RPECM-hUCMSCs的细胞形态没有发生明显变化，仍然呈成纤维细胞样（图4a,b），也不表达RPE细胞特异性标记分子RPE65（图4c），未能证明RPE-CM可诱导hUCMSCs分化为RPE细胞。根据报道，视黄酸、Αctivin-Α及BMP-7具有促进细胞向RPE细胞分化的作用[12-14]，本研究在猪RPE-CM的基础上，添加了这3种因子后再进行诱导实验。诱导培养14 d后，细胞形态发生改变，由细长型转变成上皮样，细胞排列紧密，界线清晰，呈多边形，类似于RPE细胞（图5a，b）。进一步检测确定这些细胞表达RPE65、Mitf和CK8/18等RPE细胞特异性基因（图5c），并经Q-PCR确认,RPE细胞分子标记RPE65，Mitf和Ck8/18的基因表达量分别提高了2.1 ± 0.4,6.8 ± 1.3和2.5 ± 0.3倍（图5d），证实hUCMSCs可以在体外转分化为RPE样细胞。但这些细胞没有产生色素，是与体内RPE细胞有所不同。

图3 hUCMSCs成脂、成软骨和成骨分化能力检测结果

图4 hUCMSCs在猪RPE细胞条件培养液中的分化情况

图5 猪RPE条件培养液联合诱导分子诱导hUCMSCs分化为RPE样细胞

讨 论

DRD，由于发病人多且缺乏有效治疗手段，是眼科最具挑战性的致盲性疾病之一。基于目前对DRD的认识和治疗手段，细胞/干细胞移植治疗及基因治疗可能会成为有效干预DRD的手段，因为DRD的主要病因和病理改变包括基因缺陷或RPE细胞及视网膜光感受器细胞的退行性。对ΑMD为代表的获得性视网膜变性疾病来说，视网膜细胞退行性改变是主要病理改变，因而从改善和（或）替代退行性视网膜细胞的角度看，细胞移植是合理的治疗方案。研究表明，视网膜细胞、成体干细胞、以及胚胎干细胞（embryonic stem cell, ESC）和诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSC）来源的细胞均可作为供体细胞用于治疗DRD。视网膜组织细胞作为已分化细胞，不仅材料获得困难，而且治疗效果也不理想。ESC和iPSC来源的供体细胞已经或即将在临床进行试验，但仍存在成瘤性的安全隐患。其中，ESC来源的细胞更有伦理和免疫排斥的障碍。最近，STΑP（stimulus-triggered acquisition of pluripotency）细胞/STΑP干细胞受到普遍的高度关注[15-16]，其潜在的前景可能由于不使用外来的载体及因子而好于iPS细胞，但该研究才刚刚起步，任何结论还为时尚早。相比之下，hUCMSCs作为MSCs，来源广泛，易于获得，且具有多向分化能力和强大的旁分泌作用，可以成为治疗DRD的优质供体细胞[17-19]。理论上讲，hUCMSCs作为成体干细胞，安全性应该不存在问题。

细胞/干细胞移植治疗的机理主要包括直接的细胞替代和分泌细胞因子所产生的间接作用。因此，移植的供体细胞是否能分化为受损伤的视网膜细胞是关系到干细胞移植治疗ΑMD等DRD的重要问题。Li等[20]研究发现小鼠骨髓中的MSCs能够迁移并且整合到受损伤的RPE细胞层。Huang等[8]采用RPE条件培养液和感光细胞外节成功将人的骨髓MSCs诱导分化为RPE细胞。Vossmerbaeumer等[11]采用RPE条件培养液和肠激肽联合诱导人脂肪来源的MSCs分化为RPE细胞。笔者在前期工作中，用猪RPE细胞条件培养液成功地诱导了大鼠骨髓MSCs分化为RPE细胞[10]。但在本研究中，用同样的RPE-CM并不能将hUCMSCs诱导分化为RPE细胞。其原因可能是hUCMSCs与骨髓和脂肪来源的MSCs之间存在差异。已有的研究表明，这些细胞在增殖速度以及分化能力等有明显不同[21]，因此，有理由推测这些细胞对诱导分化条件的反应也有所不同。比如分化能力的差异就可能是hUCMSCs难以被猪RPE-CM诱导分化为RPE细胞的原因。这也能解释为什么移植到RCS大鼠视网膜下腔的hUCMSCs尽管有干预作用但未能分化为RPE细胞[9]。这可能涉及hUCMSCs直接细胞替代作用以外的复杂的旁分泌作用，本文不做讨论。受RPE-CM联合肠激肽成功诱导脂肪来源MSC分化为RPE细胞启发，本研究尝试用RPE-CM联合其他因子来诱导hUCNSCs分化为RPE细胞，并且用RPECM联合视黄酸、Αctivin-Α及BMP-7成功诱导hUCMSCs分化为RPE样细胞。关于这一诱导分化的机制，笔者理解为：在胚胎发育过程中，RPE细胞的分化和成熟是受到多种因子调控而实现的，模拟成人视网膜下腔环境的RPE-CM不足以诱导hUCMSCs的RPE分化，需要有其他因子参与。胚胎发育早期阶段，生眼区转录因子（eye fi eld transcription factors, EFTFs）Tbx3、Rx、Pax6、Six3和Lhx2等决定着视网膜的早期发育[22-23]。Pax6基因突变导致RPE转分化为神经视网膜，而Six3发生突变可导致神经视网膜转分化为RPE细胞。Mitf和Otx2是视杯发育阶段RPE分化成熟的关键转录因子，缺失Mitf会导致RPE细胞分化成熟受阻，眼球背侧RPE细胞转分化为神经视网膜组织。除细胞内的关键转录因子外，细胞外信号对RPE细胞分化发育也具有重要的作用。切除眼外中胚层组织，RPE分化受到影响。当添加TGF家族成员Αctivin-Α时可以弥补中胚层组织缺失造成的影响，促进RPE细胞分化[12]。在视泡发育阶段，来自表面外胚层组织的BMP信号能够促进Mitf的表达，因而被认为是诱导RPE分化的信号[13]。而到了视杯发育阶段，视黄酸对于RPE分化发育也开始发挥重要作用，因为有研究证明视黄酸受体突变会导致RPE细胞转分化为神经视网膜组织[14]。这些研究表明，体外添加外源信号分子有助于促进MSC分化为RPE细胞。本研究中，RPE-CM未能诱导的hUCMSCs向RPE细胞分化，但在RPE-CM联合视黄酸、Αctivin-Α和BMP-7时就能得以实现，不仅证实了hUCMSCs具有向RPE细胞分化的潜能，也建立了诱导hUCMSCs分化为RPE样细胞的技术方案，为临床治疗ΑMD的DRD提供了一种比较可行的供体细胞。

综上所述，hUCMSCs能够在体外被诱导分化成RPE样细胞，表明hUCMSCs有可能会作为供体细胞治疗DRD。同时，hUCMSCs的收集具有无创性，无伦理争议等优点，并且已成为脐血库或干细胞库常规收集的一类储备细胞。使其离临床应用较其他干细胞可能更近。相信随着hUCMSCs分化为成熟的RPE细胞及光感受器细胞技术的成熟，将会为细胞移植治疗DRD提供合适的供体细胞。

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Differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells into retinal pigment epithelial like cells

Li Peng*, Li Zongyi#, Wang Li△, PHAM THi TUYET HANH, Tian Haibin, Wang Fang, Lyu Lixia , Xu Guotong.*Stem Cell Research Center, Tongji University School of Medicine and Tongji Eye institute,#Department of Ophthalmology of Shanghai Tenth People’s Hospital,△Tongji University Life Sciences and Technology, Shanghai 200092, China
Li Peng, Li Zongyi and Wang Li are the first authors who contributed equally to the article

s: Xu Guotong, Email：gtxu@tongji.edu.cn; Lu Lixia, Email：lulixia@ tongji.edu.cn

Objective The functions of the conditioned medium from porcine retinal pigment epithelial cells (RPE) on differentiation of hUCMSCs into RPE cells were investigated.Methods hUCMSCs were cultured in DMEM/F12 medium plus 10﹪ FBS and MSC specific markers on hUCMSCs were confirmed by flow cytometry. Porcine RPE conditioned media were obtained by culturing porcine RPE cells in DMEM/F12 plus 2﹪ FBS for 24 h. For differentiation, hUCMSCs were cultured in RPE conditioned medium or RPE conditioned medium plus retinoic acid (RΑ), Αctivin-Α and bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) for two weeks. hUCMSC derived RPE-like cells were confirmed by detecting the expressions of specificmarkers via PCR.ResultshUCMSCs were positive for CD105, CD90, CD73, CD44, CD29 and negative for CD34, CD45, MHCII. RPE conditioned medium alone could not promote hUCMSCs to differentiate into RPE cells. However, Rpe65+Mitf+Ck8/18+ RPE-like cells could be derived from hUCMSCs when cultured in RPE conditioned medium plus RΑ, Αctivin-Α and BMP-7. RPE-like cells exhibited polygonal morphology, but pigments were not observed in these differentiated cells.ConclusionRPE conditioned medium combined with RΑ, Αctivin-Α and BMP-7 can promote hUCMSCs to differentiate into RPE-like cells, which may provide enough cells for clinical treatment of patients with retinal degeneration disease.

Umbilical cord； Mesenchymal stem cell； Retina； Epithelial cell； Retinal degeneration

2014-01-10)

(本文编辑：蔡晓珍)

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2014.01.007

国家重大科学研究计划（2013CB967501）；国家自然科学基金（C120111；31171419）；高等学校博士学科点专项科研基金（20100072120051）

200092 上海，同济大学医学院眼科研究所及干细胞研究中心(李鹏、田海滨、吕立夏、徐国彤)；同济大学附属第十人民医院眼科（李宗义、范氏雪幸、王方）；同济大学生命科学与技术学院（王丽）

徐国彤，Email：yzliu62@yahoo.com；吕立夏，Email：lixialu@tongji.edu.cn

前三位作者对本文有同等贡献

李鹏, 王丽, 田海滨,等. 诱导人脐带间充质干细胞分化为视网膜色素上皮样细胞的研究[J/CD].中华细胞与干细胞杂志:电子版, 2014, 4(1):44-51.