星点设计-效应面优化乳化交联法制备恩诺沙星壳聚糖微球

于海峰，王洪光，徐元厂，王璐

(青岛科技大学药学系，山东青岛 266042)

恩诺沙星(Enrofloxacin)，又名乙基环丙沙星，属于氟奎诺酮类化学合成抑菌剂，具有杀菌谱广、杀菌活性强、体内分布广泛、与其他药物无交叉耐药性等特点［1］。由于恩诺沙星半衰期较短，临床多采用多剂量给药［2］。本文尝试制备恩诺沙星缓释微球，并对制备工艺进行优化。

囊材选用的壳聚糖是由自然界广泛存在的几丁质(chitin)经脱乙酰作用得到的，壳聚糖独特的化学和生物特性使其成为一种有吸引力的生物材料，并且在日常生活中被广泛应用，如处理废水、酶的固定化［3］、手术和药物传递系统［4］等。在这些应用中，壳聚糖最重要的属性是其生物相容性。

星点设计-效应面优化法是最近几年药学工作者常用的集数学和统计学方法于一体的实验设计和优化方法［5］。其特点是各实验点与中心点的距离相等，采用非线性数学模型拟合的方法，在中心点进行重复性实验，提高实验精度，预测值较正交设计和均匀设计更加接近真实值。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

恩诺沙星(浙江新昌国邦兽药厂，含量99.5%);壳聚糖(脱乙酰度 80.0% ～95.0%);液体石蜡、Span-80均为化学纯;磷酸，色谱纯;冰乙酸、戊二醛(50%)均为分析纯。

U3000型高效液相色谱仪;IT-09A5型恒温磁力搅拌器;XSP-2CA型光学显微镜;KH-250DB型数控超声波清洗器。

1.2 实验方法

精密称取处方量恩诺沙星，加至3%乙酸中，超声溶解，加入壳聚糖溶解，配成壳聚糖-恩诺沙星乙酸溶液。加入Tween-80，静置，去气泡成水相。将5 mL Span-80加入液体石蜡中，搅拌均匀成油相。边搅拌(搅拌速度900 r/min)边通过注射器将水相缓慢滴加入油相，制备成W/O型乳剂，乳化2 h后，滴加交联剂1 mL 25%戊二醛固化，固化一定时间后，静置，倾去油相，沉淀经石油醚洗涤，无水乙醇脱水，40℃真空干燥，得载药壳聚糖微球。

1.3 分析测试

1.3.1 色谱条件 色谱柱为 C18柱(4.6 mm ×200 mm，5 μm);流动相为磷酸(用三乙胺调至pH 3)-乙腈(70∶30);流速 1 mL/min;柱温为室温;检测波长 280 nm;进样量 20 μL。

1.3.2 标准曲线的制备 精密称取恩诺沙星30 mg，置100 mL量瓶中，加入5%乙酸5 mL，充分溶解，加稀磷酸定容。分别精密量取溶液1，2，3，4，5，6，7 mL，于 50 mL 容量瓶中，加稀磷酸定容，得到浓度为6，12，18，24，30，36，42 μg/mL 的一系列标准溶液。经0.45 μm的微孔滤膜过滤后，取滤液进样测定。以峰面积(Y)对进样量(X，μg)作标准曲线，得回归方程 Y=16.700X+4.585 7，R2=0.999 4。结果表明，恩诺沙星在6～42 μg/mL内线性关系良好。

1.3.3 载药量、包封率测定 将恩诺沙星壳聚糖微球100 mg置0.1 mol/L盐酸10 mL中超声10 min。37℃放置24 h，充分研磨，离心(3 000 r/min)10 min，精密吸取上清液1 mL，用0.1 mol/L NaOH中和后，用蒸馏水稀释定容至25 mL，用0.45 μm微孔滤膜过滤［6］。高效液相色谱进样，测定峰面积并计算包封率、载药量。

载药量=(微球中包含的药量/微球的质量)×100%

1.3.4 微球的粒径及形态 取微球置于载玻片上，用光学显微镜400倍放大观察其形态。照中国药典2010版第二部附录IX E粒度测定法第一法测定，计算平均粒径。

1.3.5 微球体外释放实验 精密称取一定量的载药微球，置于装有pH 7.4磷酸盐缓冲液(PBS)1 mL的透析袋中，置于具塞试剂瓶中，以PBS 100 mL为溶出介质，温度(37±0.5)℃，转速100 r/min。分别于0.25，0.5，0.75，1，2，3，4，6，8，12，18，24 h 取样5 mL，同时补充等量介质。经0.45 μm微孔滤膜过滤，测定吸收峰，并计算药物浓度和累计释放率。

2 结果与讨论

2.1 星点设计

在预实验的基础上，选择对恩诺沙星微球制备影响较大的3个因素作为考察对象。即油水相比、壳聚糖浓度、交联时间。根据CCD原理，每个因素设5个水平。各因素取值区间端点水平根据预实验结果而定。星点设计因素水平见表1。

表1 星点设计因素水平Table 1 Factors and levels for central composition design test

以包封率、载药量、平均粒径为评价指标。由于因变量较多，对某一因变量有利的条件可能对其他因变量不利，各效应间须达成妥协，使所有指标综合为一个值，可反映总体效应结果，这种方法为“归一化”法［7］。根据每个指标优选的条件，将每个因变量均标准化为0～1之间的归一值，各指标归一值求算几何平均数，得总评归一值OD=(d1d2…dn)1/n，n为指标数。对取值越小越好的因素(粒径)和取值越大越好的因素(包封率、载药量)采用Hassan方法［8］分别进行数学转换求归一值 dmin和 dmax，dmin=(ymax－yi)/(ymax－ymin)，dmax=(yi－ymin)/(ymaxymin)。再以OD值为因变量，将各因素对OD值进行多元非线性回归拟合，数学模型方程为:Y=b0+b1X1+b2X2+b3X3+b4X12+b5X22+b6X32+b7X1X2+b8X1X3+b9X2X3，星点设计结果见表2。

表2 星点设计表及结果Table 2 Results of experiment designed by CCD

以平均粒径(Y1)、包封率(Y2)、载药量(Y3)、OD值为因变量，分别对各因素(自变量)用Statistica 10.0软件进行二项式拟合，对于二项式方程，根据统计软件对各系数进行的t检验结果，删除P＞0.05的项后，再进行二项式方程拟合，达到模型简化的目的。结果如下:

2.2 效应面法优化

OD值随因素变化的三维效应面图和二维等高图见图1～图6。

图1 综合评分值(OD)对X1和X2的三维效应面Fig.1 Three-dimensional response surface of OD with two factors

图2 综合评分值(OD)对X1和X2的二维等高图Fig.2 Contour plot of OD with two factors

图3 综合评分值(OD)对X1和X3的三维效应面Fig.3 Three-dimensional response surface of OD with two factors

图4 综合评分值(OD)对X1和X3的二维等高图Fig.4 Contour plot of OD with two factors

图5 综合评分值(OD)对X2和X3的三维效应面Fig.5 Three-dimensional response surface of OD with two factors

图6 综合评分值(OD)对X2和X3的二维等高图Fig.6 Contour plot of OD with two factors

由图可知，恩诺沙星壳聚糖微球制备的最佳工艺条件为:油水相比4.2，壳聚糖浓度2%，交联时间3.5 h。

2.3 最优条件验证

按照最佳工艺条件制备3批样品，测定其平均粒径、包封率、载药量，并与预测值进行比较，结果见表3。

表3 预测值与实测值的比较(n=3)Table 3 The comparison of predictive value and measured value

由表3可知，实测值与预测值能够较好的吻合，二者偏差很小，说明通过星点设计-效应面优化的制备工艺所建立的数学模型预测性好。根据最佳工艺条件制得的微球见图7，粒径分布均匀，跨距较小，微球圆整、无粘连。

图7 优化后制得的微球显微镜照(400倍)Fig.7 Micrograph of optimized microspheres

2.4 体外释放性质考察

3批恩诺沙星原料药和恩诺沙星壳聚糖微球在24 h内的释放性测定，结果见图8。

图8 释放曲线(n=3)Fig.8 The curve of release

由图8可知，与原料药相比，微球有明显的缓释效果，微球在2 h内释放了总药量的32%，之后释药平缓，释放变慢，24 h释放了总药量的84%。体外释放数据符合 Higuchi方程，Q=0.163 9t1/2+1.248 5，R2=0.966 1。

3 结论

研究了恩诺沙星缓释微球制备工艺条件的优化，通过星点设计-效应面法安排实验并对结果进行拟合分析，以较少的实验次数，建立了油水相比、壳聚糖浓度和交联时间对归一值的二项式数学模型，描绘出效应面图和等高线图，进而得到最佳制备工艺参数:油水相比4.2∶1，壳聚糖浓度2%，交联时间3.5 h。在优化条件下制备的载药微球粒径、包封率、载药量均达到了理想的效果，同时保证了样品在24 h内能够有效的长时释放药物，从而达到良好的缓释效果，解决了恩诺沙星半衰期较短，给药频繁的问题。

［1］朱模忠.兽药手册［M］.北京:化学工业出版社，2002:103-104.

［2］于莲，董宇，李爱臣，等.恩诺沙星微囊的制备［J］.黑龙江医药科学，2008，31(6):30-31.

［3］钱军民，张兴，吕飞，等.酶固定化载体材料研究新进展［J］.化工新型材料，2002，30(10):21-24.

［4］张文婕，范颍.多糖及其衍生物在药物传递系统中的应用研究新进展［J］.药学进展，2011，35(11):496-501.

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［6］李可欣，陈大为，赵秀丽，等.RP-HPLC法测定壳聚糖微球中5-氟尿嘧啶的包封率［J］.沈阳药科大学学报，2005，22(6):434-437.

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