土壤酶和微生物量碳对土壤低浓度重金属污染的响应及其影响因子研究

线郁,王美娥,陈卫平,*

1.中国科学院生态环境研究中心城市与区域生态国家重点实验室,北京100085;

2.中国科学院大学,北京100039

土壤酶和微生物量碳是土壤生物相活跃的组成成分,是地球物质化学循环和能量转换的主要参与者,能灵敏地反应土壤质量的变化,是土壤健康状况的重要微生物指标[1-2]。人类活动引起的土壤重金属含量升高可能不会改变有机碳含量、总氮含量等土壤化学性质及植物和动物的生理活动,但能够导致土壤微生物性质发生变化[3-5]。脲酶是参与土壤氮循环的重要土壤酶之一,由于对土壤重金属污染响应敏感,是土壤重金属污染生态毒性效应研究的重要指示物,土壤 Ni、Cd、Cu、Zn、Pb、Cr污染均会导致土壤脲酶活性显著降低[6-8]。微生物量碳的含量约为土壤总有机碳含量的1% ～5%[9-11]。在一个稳定的土壤-植物生态系统中,土壤微生物量碳含量与有机碳含量的比率(MBC/SOC)保持动态恒定;在有外界干扰的情况下,譬如土壤污染、缺水等,MBC/SOC值会发生显著变化。对城市土壤、农田土壤以及自然土壤的研究发现,重金属污染会抑制微生物的繁殖从而降低MBC/SOC的值[12-14]。

由于土壤中重金属的生物有效性与土壤理化性质有关,因此土壤重金属的毒性效应不仅与重金属浓度有关,还与土壤性质有关[15-16]。Kizilkaya等[17]的研究发现,农田土壤Cd、Cu、Pb总浓度较低,分别为0.95 ～3.20 μg·g-1,23.05 ～ 96.68 μg·g-1和 76.10 ～ 210.43 μg·g-1时,脲酶活性没有显著变化。然而,当土壤Cd、Pb、Zn 浓度分别达到2.4～61.3 μg·g-1,113～7 000 μg·g-1,249 ～12 000 μg·g-1时,土壤重金属显著抑制了土壤脲酶活性[11]。Doelman和 Haanstra[8]的研究发现,Cd的半数有效量(ED50值)在砂质壤土中为 30 μg·g-1、砂土中为 120 μg·g-1、泥质壤土中为 520 μg·g-1、黏土中为 520 μg·g-1、沙质泥土中为 490 μg·g-1。Cu的ED50值在砂质壤土中为680 μg·g-1、泥质壤土中为1 990 μg·g-1、黏土中为 1 080 μg·g-1、沙质泥土中为 1 970 μg·g-1。Pb 的 ED50值在砂质壤土中为 1 590 μg·g-1、砂土中为 2 870 μg·g-1、泥质壤土中为 8 130 μg·g-1、黏土中为 1 340 μg·g-1、沙质泥土中为 7 050 μg·g-1。Zn 的 ED50值在砂质壤土中为 290 μg·g-1、砂土中为 110 μg·g-1、黏土中为 90 μg·g-1、沙质泥土中为70 μg·g-1。因此,重金属对土壤酶的毒性效应还受到土壤性质影响。

本研究拟通过野外监测和实验室模拟,研究土壤低浓度重金属污染对土壤微生物性质中脲酶活性和微生物量碳含量的影响及其对土壤理化性质的响应,并从统计分析角度揭示土壤理化性质对土壤重金属含量与土壤脲酶活性及土壤微生物量碳含量之间的剂量效应关系的影响程度。本研究结果为野外实际评价土壤重金属污染与土壤微生物性质变化之间的剂量效应关系以及土壤重金属污染生态风险评价提供基础数据和方法。

1 材料和方法(Materials and methods)

1.1 仪器与试剂

仪器:激光粒度仪Malvern Master Sizer 2 000(Malvern Co.,England),Elementar Vario ELⅢ(Hanau Germany),多功能酶标仪(SPECTRA max190),紫外分光光度计(UV-1700),总有机碳总氮分析仪 Elementar Liqui TOC(Germany)。

试剂:重金属含量测定及人为添加重金属时所用试剂为国产优级纯;其他步骤所用试剂为国产分析纯试剂。

1.2 供试土壤

野外监测选择北京五环以内建成区为研究区域,采用网格均匀布点法把研究区域分为285个网格,除掉采样受限制的网格,共采集233个样点。其中,具有代表性的公园25处,交通区58处,学校等公共场所38处,距市区2 km2以内的农田28处,工业区15处,居民区69处。取样点均为植被覆盖的绿地(如草地、林地、草坪和农田),采集表层0～20 cm的混合土壤,阴干,除去土样中石子和动植物残体等异物后,分别过2 mm和100目筛备用。

1.3 实验室模拟试验

选取3种土壤理化性质有差异的土壤(表1),将过2 mm筛的100g土壤分别放入于250mL锥形瓶中,添加 Cd、As、Pb 浓度分别为 1 μg·g-1、50 μg·g-1、500 μg·g-1(根据我国土壤环境质量标准三级标准设定),保持田间持水量的70%,28℃老化5周。测定土壤蔗糖酶、脲酶、芳香硫酸酯酶、过氧化氢酶、脱氢酶、碱性磷酸酶活性变化。

1.4 化学测定方法

土壤基本性质的测定:土壤质地划分为粘粒(clay)、粉粒(silt)、砂粒(sand),0.5 mol·L-1NaPO3处理后,用激光衍射系统Malvern Master Sizer 2000(Malvern Co.,England)测定。测定pH的水土比为1:2.5,土样与去离子水充分混匀,静置30 min后测定。阳离子交换量(CEC)的测定选择醋酸铵法[18],蒸馏过程在凯氏定氮仪上完成,再用HCl标准液滴定。土壤有机碳(SOC)的测定选用盐酸处理法[19],预处理后,使用元素分析仪Elementar Vario ELⅢ(Hanau Germany)测定有机碳含量。

土壤重金属含量的测定:称取过100目筛的土壤样品0.5000 g,用土壤环境监测技术规范(HJ/T 166-2004)中的HCl-HNO3-HF-HClO4法消解土壤。消解产物用1:1王水定容至250 mL,混匀过滤,取滤液用ICP-MS测定Cd和Pb含量;消解产物用1:1王水定容至50 mL,混匀过滤,取滤液用ICP-AES测定Cu和Zn含量。

土壤酶活性测定:蔗糖酶活性测定选用3,5-二硝基水杨酸法[20],生成的3-氨基-5-硝基水杨酸在酶标仪(SPECTRA max190)波长508 nm处比色,酶活性用 mg·葡萄糖(g·12 h)-1表示。脲酶测定选用苯酚-次氯酸钠比色法[21],生成的NH4-N在酶标仪波长578 nm处比色,酶活性用μg·NH3-N(g·3 h)-1表示。芳香硫酸酯酶活性的测定选用氢氧化钠-氯化钙比色法[22],n-硝基酚在酶标仪波长400 nm处比色,酶活性用μg n-硝基酚(g·3 h)-1表示。过氧化氢酶采用紫外分光光度法[23],生成物用紫外分光光度计(UV-1700)在波长240 nm处比色,酶活性用mg·H2O2(g·20 min)-1表示。脱氢酶活性测定选用TTC法[24],生成物在酶标仪波长400 nm处比色,酶活性用ng·TPF(g·15 h)-1表示。碱性磷酸酶活性的测定选用氯代二溴对苯醌亚胺比色法[25],生成物用酶标仪在波长578 nm处比色,酶活性用 μg苯酚(g·h)-1表示。

土壤微生物量碳(MBC)的测定选用氯仿熏蒸浸提法[26],可溶性碳的含量用总有机碳总氮分析仪Elementar Liqui TOC(Germany)测定,KEC取 0.45。

1.5 数据处理

采用SPSS 18.0软件进行描述性统计分析和相关分析;DPS软件进行方差分析(ANOVA)和多重比较;Origin 8.0软件进行拟合。在分析之前,为保证数据的正态分布特性,对测定的Cd、Cu、Zn浓度的原始数据进行自然对数转换;Pb浓度在进行自然对数转换后仍不是正态分布,需进行Box-Cox(Minitab 15)转换,转换公式为y=x-0.331。

2 结果(Results)

2.1 土壤脲酶活性、MBC含量与土壤重金属浓度的剂量效应关系

根据Wang等[27]的研究结果,北京市五环内建成区的主要重金属污染物为Cd、Pb、Cu、Zn,除了少数几个样点的重金属浓度达到土壤环境质量标准二级标准以外,其它大部分样点的浓度在背景值或以下,且具有空间浓度变化梯度,具体浓度分布见表2。

表1 实验室模拟所用土壤的理化性质Table 1 Characteristics of soil materials for laboratory simulation experiment

脲酶活性与土壤 Cd、Cu、Zn、Pb浓度剂量-效应关系可以划分为3种类型(表3)。脲酶活性与土壤Cd浓度的对数呈抛物线关系;与土壤Cu和Zn浓度的对数呈线性正相关关系;与Pb浓度呈幂指数相关,随着Pb浓度的增加,脲酶活性也增加。在北京五环以内土壤重金属的浓度范围内(Cd 0.003～0.98 μg·g-1,Cu 13.4 ～ 207.9 μg·g-1,Zn 29.4 ～ 322 μg·g-1,Pb 4.02 ～174 μg·g-1),土壤中的Cd、Cu、Zn、Pb 对脲酶活性没有抑制作用。

对MBC、SOC和MBC/SOC与土壤重金属含量的相关分析表明(表4),土壤MBC含量随着Cd和Pb的浓度增加而增加,与Cu和Zn的相关性不显著,SOC浓度随着4种重金属浓度的增加都显著增加,而MBC/SOC随着Cu、Zn、Pb的浓度增加而显著降低。以上分析结果表明,与脲酶活性类似,这几种重金属对微生物量碳含量的累积并没有显著的抑制效应,但是对MBC/SOC比值的变化有显著影响。已有研究表明,添加污泥而导致的土壤重金属Cu和Zn的累积会导致土壤MBC/SOC比值降低[28]。城市固体废弃物填埋也会由于土壤重金属含量的升高而导致土壤MBC/SOC的比值减小为对照的1/3左右[14]。

MBC/SOC与土壤 Cd、Cu、Zn、Pb 浓度剂量-效应关系可以分为3种类型(表5)。除了与土壤Cd浓度无显著相关关系外,MBC/SOC与Cu、Zn、Pb的浓度呈显著负相关关系。因此,在北京五环以内土壤重金属的浓度范围内(Cd 0.003 ～0.98 μg·g-1,Cu 13.4～207.9 μg·g-1,Zn 29.4 ～ 322 μg·g-1,Pb 4.02 ～ 174 μg·g-1),土壤重金属污染打破了土壤微生物量碳和有机碳之间的平衡,且随土壤 Cd、Cu、Zn、Pb浓度增加MBC/SOC比值减小。

表2 北京市五环以内土壤重金属浓度(μg·g-1)的统计值(N=233)［27］Table 2 Descriptive statistics on heavy metal concentrations(μg·g-1)of Beijing urban soils inside the 5th ring road(N=233)[27]

表3 土壤脲酶活性［μg·NH3-N(g·3 h)-1］与标准化的土壤重金属浓度的关系(df=232)Table 3 Relationships between urease activities and ln(Cd),ln(Zn),ln(Cu)and Pb-0.331in soils

以上分析结果表明,土壤脲酶活性、MBC/SOC与土壤重金属的剂量效应关系存在一定的剂量效应关系,但是决定系数均较低,脲酶活性土壤重金属浓度的决定系数为0.05～0.10(表3),只能解释变异系数的5% ～10%。MBC/SOC与这几种重金属的剂量效应关系大部分的决定系数只能解释总变异的5% ～6%,与Zn浓度的决定系数最高,但也只能解释变异的10%(表5)。以上野外监测的数据表明,在北京市建成区区域,土壤重金属的累积没有对土壤脲酶产生抑制作用,对于微生物量碳与有机碳之间的平衡有显著影响,但是影响程度不高。

表4 土壤重金属含量与土壤微生物生物量碳相关指标的相关性Table 4 Correlation of soil heavy metal concentration and MBC,SOC,and MBC/SOC

2.2 土壤重金属污染和土壤性质对土壤脲酶活性的单一和联合效应

土壤因子和重金属因子单独和复合效应分析结果表明,土壤中的6种受试土壤酶活性均受两因素的联合作用影响(表6,土壤 ×重金属 p值均小于0.05)。而重金属的单一作用只对蔗糖酶和脱氢酶活性变化有显著影响;土壤性质不同导致除脱氢酶以外的5种土壤酶活性都发生了显著变化。

相关分析表明,土壤脲酶活性与土壤有机质和土壤粘粒含量显著正相关(表7,r值分别为0.943和0.937),且均达到极显著水平。但土壤粘粒含量与土壤有机质含量极显著相关,相关系数达0.999,这与土壤有机质的粒级组成有关,同时也表明两因子之间存在共线性,为避免模拟过程中引入具有多重共线性的参数,选择土壤有机质含量进行后面的研究。此外,脲酶活性也与土壤pH显著负相关(r分别为-0.649),这是因为受试土壤均为碱性土,而pH=6.7是脲酶最适酸碱度。

表5 MBC/SOC与标准化的土壤重金属浓度的关系(df=232)Table 5 Relationships between MBC/SOC and ln(Zn),ln(Cu)and Pb-0.331in soils

表6 土壤酶活性受土壤性质和重金属影响的方差分析Table 6 ANOVA analysis of enzyme activities in heavy metal polluted soils with different properties

表7 土壤脲酶活性［μg·NH3-N(g·3h)-1］与土壤性质的相关分析(n=12)Table 7 Correlation between urease activity and soil property(n=12)

2.3 土壤理化性质对土壤脲酶活性、MBC/SOC与土壤重金属污染的剂量效应关系的影响

根据表7脲酶活性与土壤性质的相关性分析结果,引入土壤有机质含量(SOC)和土壤pH作为主要的影响因子,对野外监测数据进行进一步的剂量效应关系分析。引入SOC和pH两个参数后,重新计算的土壤脲酶活性、MBC/SOC与Cd、Cu、Zn、Pb浓度的相关系数为0.14～0.17(表8和表9),增加一倍左右。其中,土壤脲酶活性、MBC/SOC在表征Cd污染时,R2增加均超过10%,表明了这两种土壤性质对Cd的毒性效应有很大程度的影响。MBC/SOC与脲酶活性相比,决定系数R2增加更多,表明MBC/SOC比土壤脲酶活性对这两种土壤性质更为敏感。

上述结果也表明,除了土壤重金属浓度、土壤有机碳含量和pH值,还有未被考虑的因素影响土壤酶活性和微生物量碳对土壤重金属的响应,所有其它因素的决定系数超过80%。土壤重金属的毒性效应还受到季节、植被覆盖以及复合污染的联合效应等影响。土壤微生物的活性有季节性波动,Zhang等[29]相关研究指出,重金属对土壤酶的作用在春天和夏天比秋天明显。植被因素也会影响重金属对土壤微生物和土壤酶的毒性效应。Yang等[30]的研究指出,植物种类相对复杂的地区土壤脲酶的活性相对较高。重金属复合效应对土壤酶和微生物的作用也与单一重金属效应不同,Khan等[31]指出Cd和Pb共存时对土壤酶活性的抑制作用大于单一重金属。而Wyszkowska等[32]的研究表明单一重金属Cu对土壤酶的毒性作用大于 Cu 与 Zn、Ni、Pb、Cd、Cr的复合作用。3种重金属共存时,由于协同作用的影响,对土壤酶的抑制作用要大于单一重金属[33]。如何综合并定量化这些因素将是完善土壤重金属生态风险评价的关键。

综合以上的研究结果表明,土壤酶活性和微生物碳含量受重金属含量和土壤性质联合效应的影响。在北京建成区土壤重金属的含量范围内(Cd 0.003 ～0.98 μg·g-1,Cu 13.4 ～ 207.9 μg·g-1,Zn 29.4 ～3 22μg·g-1,Pb4.02 ～ 174μg·g-1),土壤重金属含量只能解释脲酶活性变化和MBC/SOC变化的5%～10%;通过室内模拟实验引入土壤有机质含量和pH两个土壤性质参数后,重新建立的脲酶活性、MBC/SOC与土壤重金属浓度的相关系数变大,可以解释总变异的14%～17%。

表8 脲酶活性与土壤性质、标准化重金属浓度的关系Table 8 Relationships between urease activities and soil properties and ln(Cd),ln(Zn),ln(Cu)and Pb-0.331in soils

表9 MBC/SOC与土壤性质、标准化重金属浓度的关系Table 9 Relationships between MBC/SOC and soil properties and ln(Cd),ln(Zn),ln(Cu)and Pb-0.331in soils

[1]Balasubramanian A,Siddaramappa R,Rangaswami G.Effect of organic manuring on the activities of the enzymes hydrolysing sucrose and urea and on soil aggregation[J].Plant and Soil,1972,37(2):319－328

[2]Brookes P C.The use of microbial parameters in monitoring soil pollution by heavy metals[J].Biology and Fertility of Soils,1995,19(4):269－279

[3]Giller K E,Witter E,McGrath S P.Toxicity of heavy metals to microorganisms and microbial processes in agricultural soils:A review[J].Soil Biology and Biochemistry,1998,30(10-11):1389－1414

[4]周启星,王美娥.土壤生态毒理学研究进展与展望[J].生态毒理学报2006,1(1):1－11 Zhou Q X,Wang M E.Researching advancement and prospect of soil ecotoxicology[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2006,1(1):1－11(in Chinese)

[5]Chaperon S,Sauve S.Toxicity interaction of metals(Ag,Cu,Hg,Zn)to urease and dehydrogenase activities in soils[J].Soil Biology and Biochemistry,2007,39(9):2329－2338

[6]Moreno J L,García C,Hernández T.Toxic effect of cadmium and nickel on soil enzymes and the influence of adding sewage sludge[J].European Journal of Soil Science,2003,54(2):377－386

[7]Kandeler E,Tscherko D,Bruce K D,et al.Structure and function of the soil microbial community in microhabitats of a heavy metal polluted soi[J]l.Biology and Fertility of Soils,2000,32(5):390－400

[8]Doelman P,Haanstra L.Short-and long-term effects of heavy metals on urease activity in soils[J].Biology and Fertility of Soils,1986,2(4):213－218

[9]Sparling G.Ratio of microbial biomass carbon to soil organic carbon as a sensitive indicator of changes in soil organic matter[J].Soil Research,1992,30(2):195－207

[10]Anderson T H,Domsch K H.Determination of ecophysiological maintenance carbon requirements of soil microorganisms in a dormant state[J].Biology and Fertility of Soils,1985,1(2):81－89

[11]Mikanova O.Effects of heavy metals on some soil biological parameters[J].Journal of Geochemical Exploration,2006,88(1-3):220－223

[12]Yang Y,Paterson E,Campbell C D.Urban soil microbial features and their environmental significance as exemplified by Aberdeen City,UK[J].Chinese Journal of Geochemistry,2001,20(1):34－44

[13]Bhattacharyya P,Mitra A,Chakrabarti K,et al.Effect of heavy metals on microbial biomass and activities in century old landfill soil[J].Environmental Monitoring and Assessment,2008,136(1-3):299－306

[14]Bastida F,Zsolnay A,Hernández T,et al.Past,present and future of soil quality indices:A biological perspective[J].Geoderma,2008,147(3 4):159－171

[15]Karaca A,Cetin S C,Turgay O C,et al.Effects of heavy metals on soil enzyme activities[J].Soil Heavy Metals,2010,237－262

[16]Moreno J L,Bastida F,Ros M,et al.Soil organic carbon buffers heavy metal contamination on semiarid soils:Effects of different metal threshold levels on soil microbial activity[J].European Journal of Soil Biology,2009,45(3):220－228

[17]Kızılkaya R,Akşn T,Bayraklı B,et al.Microbiological characteristics of soils contaminated with heavy metals[J].European Journal of Soil Biology,2004,40(2):95－102

[18]Gillman G P,Bruce R C,Davey B G,et al.A comparison of methods used for determination of cation exchange capacity[J].Communications in Soil Science and Plant Analysis,1983,14(11):1005－1014

[19]Nam J J,Thomas G O,Jaward F M,et al.PAHs in background soils from Western Europe:Influence of atmospheric deposition and soil organic matter[J].Chemosphere,2008,70(9):1596－1602

[20]Frankeberger W,Johanson J.Method of measuring invertase activity in soils[J].Plant and Soil,1983,74(3):301－311

[21]Gosewinkel U,Broadbent F.Conductimetric determination of soil urease activity[J].Communications in Soil Science&Plant Analysis,1984,15(11):1377－1389

[22]Tabatabai M,Bremner J.Arylsulfatase activity of soils[J].Soil Science Society of America Journal,1970,34(2):225－229

[23]Johnson J L,Temple K L.Some variables affecting the measurement of"catalase activity"in soil1[J].Soil Science Society of America Journal,1964,28(2):207－209

[24]Stevenson I L.Dehydrogenase activity in soil[J].Canadian Journal of Microbiology,1959,5(2):229－235

[25]Kramer M,Yerdei G.Application of the method of phosphatase activity determination in agricultural chemistry[J].Soviet Soil Science,1959,9:1100－1103

[26]Vance E D,Brookes P C,Jenkinson D S.An extraction method for measuring soil microbial biomass C[J].Soil Biology and Biochemistry,1987,19(6):703－707

[27]Wang M E,Markert B,Chen W P,et al.Identification of heavy metal pollutants using multivariate analysis and effects of land uses on their accumulation in urban soils in Beijing,China[J].Environmental Monitoring and Assessment,2012,184:5889－5897

[28]Chander K,Brookes P C.Effects of heavy metals from past applications of sewage sludge on microbial biomass and organic matter accumulation in a sandy loam and a silty loam UK soil[J].Soil Biology and Biochemistry,1991,23(10):927－932

[29]Zhang Y,Zhang H W,Su Z C,et al.Soil microbial characteristics under long-term heavy metal stress:A case study in Zhangshi Wastewater Irrigation Area,Shenyang[J].Pedosphere,2008,18(1):1－10

[30]Yang R,Tang J,Chen X,et al.Effects of coexisting plant species on soil microbes and soil enzymes in metal lead contaminated soils[J].Applied Soil Ecology,2007,37(3):240－246

[31]Khan S,Cao Q,Hesham A E-L,et al.Soil enzymatic activities and microbial community structure with different application rates of Cd and Pb[J].Journal of Environmental Sciences,2007,19(7):834－840

[32]Wyszkowska J,Kucharski J,Lajszner W.The effects of copper on soil biochemical properties and its interaction with other heavy metals[J].Polish Journal of Environmental Studies,2006,15(6):927－934

[33]Yang Z,Liu S,Zheng D,et al.Effects of cadium,zinc and lead on soil enzyme activities[J].Journal of Environmental Sciences,2006,18(6):1135－1141