玉郎伞查尔酮对异丙肾上腺素致小鼠心室重构的保护作用*

黄建春,刘聪慧,周欢欢,谭丽凤,黄建静,李典鹏,黄仁彬

(1.广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所、广西植物功能物质研究与利用重点实验室,桂林 541006;2.广西医科大学药学院,南宁 530021;3.广西医科大学第一临床医学院,南宁 530021)

玉郎伞查尔酮对异丙肾上腺素致小鼠心室重构的保护作用*

黄建春1,2,刘聪慧3,周欢欢3,谭丽凤2,黄建静2,李典鹏1,黄仁彬2

(1.广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所、广西植物功能物质研究与利用重点实验室,桂林 541006;2.广西医科大学药学院,南宁 530021;3.广西医科大学第一临床医学院,南宁 530021)

目的 研究玉郎伞查尔酮对异丙肾上腺素(ISO)致小鼠心室重构的保护并探讨其机制。方法50只小鼠随机分为空白对照组,模型组,卡托普利组,玉郎伞查尔酮低、高剂量组,每组10只。除空白对照组外其他组采用连续7 d皮下注射ISO 1 mg·kg-1诱导小鼠心室重构模型。卡托普利组灌胃给予卡托普利65 mg·kg-1,玉郎伞查尔酮低、高剂量组尾静脉注射玉郎伞查尔酮2.5,5.0mg·kg-1,给药10 d。实验结束时计算小鼠心脏、双肾、肺质量指数,观察心肌病理形态学改变,比色法测定血清中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性,心肌组织羟脯氨酸(Hyp)含量。苏木精-伊红(HE)和Masson’s染色,分析系统测量心肌细胞横截面积(CSA)、心肌间质胶原容积分数(CVF)和血管周围胶原面积(PVCA)的变化。结果与空白对照组比较,模型组小鼠心脏、双肾、肺质量指数明显升高,血清SOD活性下降,血清MDA含量升高。与模型组比较,玉郎伞查尔酮组的心脏、双肾和肺质量指数明显降低,MDA含量明显降低(P＜0.01或P＜0.05)、SOD活性明显升高(P＜0.01)、心肌组织中Hyp含量明显降低(P＜0.01)。心肌胶原含量半定量分析显示,CVF和PVCA显著降低(P＜0.01)。结论玉郎伞查尔酮对ISO诱导的小鼠心室重构具有保护作用,其机制可能与清除氧自由基,提高机体的抗氧化能力有关。

玉郎伞查尔酮;异丙肾上腺素;心室重构

心室重构是心脏对多种心血管疾病的代偿性反应,特征表现为心肌细胞的肥大而非增殖以及心肌组织的纤维化等,尽管最初的代偿性肥厚可能有益于临床症状的改善,但是持久的重构最终会导致心力衰竭。导致心室重构的因素包括机械负荷增加和交感神经活性升高[1]。玉郎伞(又称龙眼参)是广西壮族的一种习用草药,为蝶形花科疏叶崖豆Millettia pulchraKurz var.laxior(Dunn)Z.Wei的块根,具有补气、补血、提高免疫力、抗衰老和抗应激等功能。玉郎伞查尔酮是由本课题组从玉郎伞60%乙醇提取物中分离得到的黄酮单体[2],前期的研究表明其具有清除自由基、抗氧化、耐缺氧和抗凝血作用[3],对心肌细胞缺氧/复氧损伤具有明显的保护作用[4-6],同时对大鼠心肌缺血再灌注损伤具有显著的保护作用[7-8],但其对于心室重构有无干预作用笔者尚未见报道。小剂量连续皮下注射异丙肾上腺素(isoprenaline,ISO)可以明显诱导实验动物发生心肌细胞肥大和心肌间质的纤维化[9],笔者在本研究拟观察玉郎伞查尔酮对ISO致小鼠心室重构的保护作用及机制,以期为临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物 昆明种小鼠50只,SPF级,雌雄各半,体质量18～22 g,由广西医科大学实验动物中心提供,许可证号:SCXK(桂)2009-0002。

1.2 药材 玉郎伞,采自广西灵山县,经广西中医药研究院赖茂祥研究员鉴定为蝶形花科植物疏叶崖豆Millettia pulchraKurz var.laxior(Dunn)Z.Wei的块根。

1.3 试剂 ISO购自上海禾丰制药有限公司,批号: 120307;卡托普利购自湖南湘雅制药有限公司,批号: 1201112;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)试剂盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)试剂盒、羟脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供,批号分别为20130729,20130715, 20130906。

1.4 模型制备、分组与给药 将小鼠随机分为5组,每组10只,分别为空白对照组、模型组、玉郎伞查尔酮低剂量组、玉郎伞查尔酮高剂量组、卡托普利组。根据文献[10-12]略加改进制备小鼠心肌肥厚模型,除空白对照组外,其他各组均给予ISO 1 mg·kg-1,sc,每天2次,间隔8 h,连续7 d。空白对照组皮下注射等容量0.9%氯化钠溶液。每日上午注射给药后4 h,玉郎伞查尔酮低、高剂量组尾静脉注射玉郎伞查尔酮2.5, 5 mg·kg-1,给药容积为10 mL·kg-1。卡托普利组灌胃卡托普利65 mg·kg-1,给药容积为20 mL·kg-1,均每天1次,连续14 d。模型组和空白对照组灌胃给予等容量0.9%氯化钠溶液。

1.5 测量指标

1.5.1 心脏、双肾、肺质量指数测定 小鼠末次给药后禁食不禁水12 h,称取体质量,摘眼球取血后脱颈椎处死小鼠,迅速开胸取心脏、双肾、肺,0.9%氯化钠溶液洗尽残血,滤纸吸干后称量心脏、双肾及肺质量,并计算心脏、双肾、肺质量指数。

1.5.2 病理学指标观察 10%甲醛溶液固定心肌组织梯度酒精脱水,常规石蜡包埋,心肌组织5μm连续切片,行苏木精-伊红(hemotoxylin-eosin,HE)和Masson’s染色,用形态学图像分析系统测量心肌细胞横截面积(cross section area,CSA)、心肌间质胶原容积分数(collagen volume fraction,CVF)和血管周围胶原面积(perivascular circumferential collagen area,PVCA)的变化。CSA(%)=各组心肌细胞横截面积/空白对照组心肌细胞横截面积×100%;CVF(%)=胶原面积/心肌总面积×100%;PVCA(%)=心室内小动脉管腔周围面积/动脉管腔面积×100%。

1.5.3 血清SOD活性及MDA含量测定 SOD活性测定采用黄嘌呤氧化酶法,严格按照试剂盒说明在波长550 nm处测定血清中SOD活性。MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法,严格按照试剂盒说明在波长532 nm处测定血清中MDA含量。

1.5.4 心肌组织Hyp含量测定 Hyp含量测定采用二甲氨基苯甲醛法,严格按照试剂盒说明操作,在波长550 nm处测定心肌组织Hyp含量。

1.6 统计学方法 采用SPSS 10.0统计分析软件进行统计学分析。所有数据均以均数±标准差(±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用LSD-t检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 玉郎伞查尔酮对ISO诱导的心室重构小鼠心脏、双肾、肺质量指数的影响 小鼠连续皮下注射ISO7 d后,与空白对照组比较,模型组心脏、双肾、肺质量指数明显升高;给予低剂量、高剂量玉郎伞查尔酮和卡托普利后可明显抑制心脏、双肾、肺质量指数的增加,与模型组比较,均差异有统计学意义(均P＜0.05),表明玉郎伞查尔酮可抑制ISO引起的心肌肥厚。见表1。

2.2 玉郎伞查尔酮对ISO诱导心室重构小鼠CSA、CVF、PVCA和心肌组织Hyp含量的影响 与空白对照组比较,模型组小鼠心肌细胞CSA明显增加,差异有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较,玉郎伞查尔酮高剂量、低剂量组和卡托普利组CSA有下降趋势,差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。Masson’s染色显示心肌细胞呈红色,胶原纤维呈蓝绿色。心肌胶原含量半定量分析显示,与模型组比较,玉郎伞查尔酮高剂量、低剂量组和卡托普利组CVF和PVCA有降低,差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。模型组ISO连续皮下注射7 d后,小鼠心肌组织中Hyp含量与空白对照组比较明显增加(P＜0.01)。高剂量、低剂量玉郎伞查尔酮和卡托普利治疗后能明显抑制心肌组织中Hyp含量的增加,与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。见表2和图1,2。

表1 5组小鼠心脏、双肾、肺质量指数的检测值Tab.1 Detection resu lts of weight index of heart,kidneys and lung in five groups of mice mg·g-1,±s

表1 5组小鼠心脏、双肾、肺质量指数的检测值Tab.1 Detection resu lts of weight index of heart,kidneys and lung in five groups of mice mg·g-1,±s

与空白对照组比较,*1P＜0.01,*2P＜0.05;与模型组比较,*3P＜0.01,*4P＜0.05Compared with blank control group,*1P＜0.01,*2P＜0.05; Compared with model group,*3P＜0.01,*4P＜0.05

只心脏指数双肾指数肺重量指数空白对照组组别小鼠/ 10 4.20±0.62 10.88±1.37 5.26±0.47模型组10 5.07±0.59*112.30±1.42*25.90±0.63*2卡托普利组10 3.03±0.79*311.02±0.61*45.30±0.55*4玉郎伞查尔酮高剂量组10 4.32±0.51*310.27±0.64*35.32±0.55*4低剂量组10 4.37±0.58*410.82±1.28*45.42±0.42*3

表2 5组小鼠CSA、CVF、PVCA和心肌组织Hyp含量的检测值Tab.2 Detection results of CSA,CVF,PVCA and Hyp content of heart tissue in five groups of mice±s

表2 5组小鼠CSA、CVF、PVCA和心肌组织Hyp含量的检测值Tab.2 Detection results of CSA,CVF,PVCA and Hyp content of heart tissue in five groups of mice±s

与空白对照组比较,*1P＜0.01;与模型组比较,*2P＜0.01,*3P＜0.05Compared with blank control group,*1P＜0.01;Compared withmodel group,*2P＜0.01,*3P＜0.05

?

A.心肌细胞长轴(HE,×100);B.心肌细胞的横截面(HE,×400);1.空白对照组;2.模型组;3.玉郎伞查尔酮低剂量组;4.玉郎伞查尔酮高剂量组;5.卡托普利组图1 5组小鼠CSA的病理图A.long axis of myocardial cells(HE,×100);B.cross-section of myocardial cell(HE,×400);1.Blank control group;2.Model group;3. Low-dose MHBFC group;4.High-dose MHBFC group;5.Captopril group.Fig.1 Pathological figure on CSA of five grous of mice

A.心肌间质纤维化;B.心肌血管周围纤维化;1.空白对照组;2.模型组;3.玉郎伞查尔酮低剂量组;4.玉郎伞查尔酮高剂量组; 5.卡托普利组图2 5组小鼠CVF和PVCA的病理切片图(M asson's×400)A.Myocardial interstitial fibrosis;B.Myocardial perivascular fibrosis;1.Blank control group;2.Modelgroup;3.Low-dose MHBFC group; 4.High-dose MHBFC group;5.Captopril group.Fig.2 Pathological figure on CVF and PVCA of five groups of mice

2.3 玉郎伞查尔酮对ISO诱导心室重构小鼠血清SOD活性和MDA含量的影响 ISO连续皮下注射7 d后,小鼠血清中SOD活性与空白对照组相比明显下降(P＜0.01),MDA含量明显增加(P＜0.01)。玉郎伞查尔酮低剂量、高剂量组和卡托普利组治疗后能明显抑制小鼠血清中SOD活性的降低和MDA含量的升高,与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.01),见表3。

表3 5组小鼠血清中SOD和MDA的含量Tab.3 Content of serum SOD and MDA in five groups of m、ice

3 讨论

笔者在本实验中采用ISO皮下注射法制备小鼠心室重构模型,这种模型在学术界已有广泛应用、方法可靠[10-13]。心室重构的形态学改变主要涉及心肌细胞和细胞外基质的变化,心肌间质中基质胶原的增加,以及胶原类型、组分、相互连接的改变是“心室重构”的重要组成部分。持续给予ISO后,模型组心肌中清除氧自由基的SOD活性降低,而反映组织过氧化程度的MDA浓度升高,说明心肌肥大的病理过程中有氧化应激的参与。过量的氧自由基作用于细胞膜上的不饱和脂肪酸,使膜脂质产生过氧化反应,造成心肌的不可逆性坏死。Hyp占胶原中总氨基酸的13.4%,可以代表胶原的水平,心肌肥厚的发生过程中,心肌Hyp水平升高,心肌细胞表型变化,体积增大,心肌细胞内收缩蛋白的类型改变,心肌间质细胞增殖,纤维组织增生,产生大量的胶原和纤维素,使心肌结构紊乱[14]。

笔者在本实验中发现,与空白对照组比较,模型组小鼠心脏质量指数,心肌细胞CSA及心肌间质CVF显著增加,差异有统计学意义(P＜0.01),说明心肌肥厚模型制备成功。与模型组比较,玉郎伞查尔酮高剂量、低剂量组和卡托普利组MDA含量明显降低(P＜0.01或P＜0.05)、SOD活性升高(P＜0.01)、抑制心肌组织中Hyp含量(P＜0.05)。心肌胶原含量半定量分析显示,CVF和PVCA显著降低(P＜0.01)。提示玉郎伞查尔酮对ISO诱导的小鼠心室重构具有一定的逆转作用,其机制可能与清除氧自由基,提高机体的抗氧化能力,抑制脂质过氧化物产生,减轻脂质过氧化所致心肌细胞膜的损伤等有关,其他相关信号转导机制正在进一步的深入探讨中。

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DOI 10.3870/yydb.2014.06.003

Protective Effects of 17-Methoxyl-7-hydroxy-benzene-furabcgakcone on Isoproterenolinduced Ventricular Remodeling in Mice

HUANG Jian-chun1,2,LIU Cong-hui3,ZHOU Huan-huan3,TAN Li-feng2,HUANG Jian-jing2,LI Dianpeng1,HUANG Ren-bin2
(1.Guangχi Key Laboratory of Functional Phytochemicals Research and Utilization, Guangχi Institute of Botany,Guangχi Zhuang Autonomous Region and Chinese Academy of Sciences,Guilin 541006,China;2.Pharmaceutical School,Guangχi Medical University,Nanning 530021,China;3.The First Clinical College,GuangχiMedical University,Nanning 530021,China)

ObjectiveTo investigate the effects of 17-methoxyl-7-hydroxy-benzene-furabcgakcone(MHBFC)on isoproterenol-induced ventricular remodeling inm ice.MethodsIsoproterenol(ISO)was given subcutaneously(1 mg·kg-1, twice per day for 7 d)to induce ventricular remodeling in mice.Mice were divided into normal control group,model group, captopril group,MHBFC low and high-dose groups.65 mg·kg-1captopril was given by intragastric administration in captopril group,2.5,5.0 mg·kg-1MHBFC were given by intravenous injection in MHBFC low and high-dose groups.At the end of the 7th day,the hearts of the mice were weighted,and myocardial hypertrophy index was expressed as heart weight/body weight, double kidneys weight/body weight and lung weight/body weight(HW/BW,KW/BW and LW/BW).Colorimetric method was used to determ ine the content of hydroxyproline(Hyp)in heart,the activity of superoxide dismutase(SOD)and the content of malondialdehyde(MDA)in serum.The histological changeswere observed by HE and Masson’s staining,the changes of cross section area(CSA),collagen volume fraction,(CVF)and perivascular circumferential collagen area(PVCA)were determined.ResultsCompared with themodel group,MHBFC potently inhibited cardiomyocyte hypertrophy,decreased the HW/BW, KW/BW and LW/BW,improved cardiac pathology changed,increased the of activity SOD,decreased the content of MDA in serum and the content of Hyp in heart tissue(P＜0.01 orP＜0.05),decreased the CVF and PVCA(P＜0.01).ConclusionMHBFC possesses protective effects against ISO-induced ventricular remodeling inmice,whichmay be related to its actions in reducing the oxidative stress and improving the antioxidant activity of the body.

17-methoxyl-7-hydroxy-benzene-furanchalcone;Isoproterenol;Ventricular remodeling

R285.5

A

1004-0781(2014)06-0703-05

2013-10-23

2013-12-27

*广西植物功能物质研究与利用重点实验室开放基金资助(FPRU2013-3);广西自然科学基金资助项目(2013GXNSFAA019175);2012年优秀博士学位论文培育项目(YCBZ2012013)

黄建春(1980-),女,广西贵港人,讲师,博士,研究方向:抗肝炎药物,心脑血管药理学研究。电话:0771-5329140,E-mail:huangjianchun008@163.com。

李典鹏(1968-),男,广西桂林人,研究员,博士,研究方向:植物活性物开发与利用。电话:0773-3550103, E-mail:ldp@gxib.cn。

黄仁彬(1955-),男,广西灵山人,教授,博士生导师,博士,研究方向:抗肝炎、抗肿瘤药物和心脑血管药理学研究。电话: 0771-5339805,E-mail:huangrenbin518@163.com。