花芪颗粒质量控制*

王莹,郭飞燕,王鹏远,贺文娟,王晓娟

(第四军医大学口腔医院药剂科,军事口腔医学国家重点实验室,西安 710032)

花芪颗粒质量控制*

王莹,郭飞燕,王鹏远,贺文娟,王晓娟

(第四军医大学口腔医院药剂科,军事口腔医学国家重点实验室,西安 710032)

目的 建立花芪颗粒的质量标准。方法采用薄层色谱法对花芪颗粒中黄芪、生地、麦冬和当归进行定性鉴别。采用高效液相色谱法测定生地中梓醇的含量,色谱柱:Diamonsil®C18(2)分析柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相:乙腈-0.1%磷酸溶液(0.5∶99.5),流速:1.0 mL·min-1,柱温:25℃,检测波长:210 nm,进样量:10 μL。结果黄芪、生地、麦冬和当归的薄层色谱斑点清晰,阴性对照无干扰,专属性强。梓醇在0.241～0.724 mg范围内与峰面积线性关系良好(r=0.999 8),平均加样回收率为95.19%,RSD为3.20%(n=9)。结论该方法能准确可靠地进行定性、定量分析,可用于花芪颗粒的质量控制。

花芪颗粒;梓醇;质量控制;色谱法,薄层;色谱法,高效液相

口干是口腔疾病及某些系统疾病的常见症状之一,是口腔内唾液缺乏所引起的一种症状,针对口干症的病因进行治疗,是最有效的方法。中医将口干燥症归之为“燥症”范畴,阴虚致燥为根本原因,治则为滋阴生津、润燥健脾。治疗采用的中药主要有生地、熟地、麦冬、当归、石斛、玉竹等[1-2]。花芪颗粒主要由生地、黄芪、麦冬、天冬、当归、石斛、白花蛇舌草、莪术、半枝莲、三棱和肉苁蓉等11味中药材经提取、浓缩后制成,可用于治疗干燥综合征、老年性口干症、药物及精神因素引起的口干症、经前期及绝经期引起的口干症等。为了有效控制其质量,笔者采用高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)法对花芪颗粒中君药生地进行含量测定,并对花芪颗粒中各味药材进行薄层色谱(thin-layer chromatography,TLC)研究,最终确定黄芪、生地、麦冬和当归的薄层色谱鉴别条件。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LC-2010A高效液相色谱仪,紫外检测器, LC-Solution色谱工作站(日本岛津制作所);DL-720超声仪(浙江石浦海天电子仪器厂);BT125D分析天平(精度:0.01/0.1 mg;量程:40/120 g,北京赛多利斯科学仪器有限公司)。

1.2 试药 梓醇对照品(批号:110808-201009,纯度: 94.4%)、黄芪甲苷对照品(供含量测定用,批号: 110781-200613)、阿魏酸对照品(供含量测定用,批号: 110773-201012)、麦冬对照药材(批号:121013-201009)和生地对照药材(批号:121180-200604)均购自中国食品药品检定研究院。花芪颗粒[兰制字(2011)F70006]3批(批号:121126,130119,130305),由第四军医大学口腔医院药剂科提供;甲醇、乙腈为色谱纯,其他试剂均为分析纯,水为二次纯化水。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别

2.1.1 黄芪薄层鉴别 取花芪颗粒12 g,研细,加正丁醇30 mL加热回流1 h,滤过,滤液加于中性氧化铝柱(100～120目,5 g,内径10～15 mm)上,用1%氢氧化钠溶液100 mL洗脱3次,收集洗脱液,弃去碱液,再用正丁醇饱和的水洗脱3次至溶液呈中性,弃去水层,正丁醇蒸干,残渣加甲醇1 mL溶解,作为供试品溶液;另取黄芪甲苷对照品,加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液,作为对照品溶液;再取阴性颗粒12 g和黄芪对照药材2 g,按照供试品溶液的制法制成阴性对照品溶液和对照药材溶液。照薄层色谱法(《中华人民共和国药典》2010年版一部附录ⅥB)实验,吸取上述4种溶液各2 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷∶甲醇∶水(13∶7∶2)的下层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰,置波长365 nm紫外灯下检视。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上(Rf值相同,Rf=0.68),日光下显相同的棕褐色斑点;紫外灯(波长365 nm)下,显相同的橙黄色荧光斑点,且阴性无干扰,薄层色谱结果见图1。

2.1.2 生地薄层鉴别 称取花芪颗粒8 g,研细,加甲醇20 mL,超声提取20 min,过滤,滤液回收甲醇至5 mL,作为供试品溶液。取生地对照药材2 g和阴性颗粒8 g,同上处理,作为对照药材溶液和阴性对照品溶液。照薄层色谱法实验,吸取上述4种溶液各5 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水(14∶6∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以香草醛硫酸试液,105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上(Rf值相同,Rf= 0.39),显相同颜色的斑点,且阴性无干扰,薄层色谱结果见图2。

图1 黄芪的薄层色谱图

图2 生地的薄层色谱图

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2.1.3 麦冬薄层鉴别 称取花芪颗粒剂24 g,研细,加三氯甲烷-甲醇(7∶3)混合溶液20 mL,浸泡3 h后,超声处理30 min,放至室温,滤过,滤液蒸干,残渣加三氯甲烷1 mL使之溶解,作为供试品溶液。另取麦冬对照药材0.25 g和阴性颗粒24 g,同法制成对照药材溶液和阴性对照溶液。照薄层色谱法,吸取上述3种溶液各10 μL,分别点于同一硅胶G254薄层板上,以甲苯-甲醇-冰醋酸(80∶5∶0.1)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(波长254 nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应位置上(Rf值相同,Rf= 0.28),出现相同颜色的清晰的斑点,且阴性无干扰,薄层色谱图结果见图3。

图3 麦冬的薄层色谱图

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2.1.4 当归薄层鉴别 称取花芪颗粒12 g,研细,加1%碳酸氢钠溶液50 mL,超声处理30 min后,离心10 min,取上清液用10%稀盐酸调节pH至2～3,用乙醚振摇提取2次,每次20 mL,合并乙醚液,蒸干,残渣加甲醇1 mL使溶解,作供试品溶液。另取阿魏酸对照品适量,加甲醇配成每毫升含1 mg的溶液,作为对照品溶液。再取阴性颗粒12 g和当归对照药材0.5 g,按照供试品溶液的制法制成阴性对照品溶液和对照药材溶液。照薄层色谱法,吸取上述4种溶液各10 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(4∶1∶1∶0.1)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外灯(波长365 nm)下检视。供试品色谱中,在与对照品相应的位置上(Rf值相同,Rf=0.35),出现相同颜色的清晰的荧光斑点,且阴性无干扰,薄层色谱结果见图4。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱:Diamonsil®C18(2)分析柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相:乙腈-0.1%磷酸溶液(0.5∶99.5),流速:1.0 mL·min-1,柱温:25℃,检测波长:210 nm,进样量:10 μL。理论板数按梓醇峰计算应不低于5 000。

2.2.2 溶液的配制

2.2.2.1 对照品溶液的配制 取梓醇对照品约10 mg,精密称定为10.05 mg,置25 mL量瓶中,用二次纯化水溶解并定容至刻度,摇匀,即得梓醇对照品储备液(0.402 mg·mL-1)。精密量取对照品储备液1 mL置10 mL量瓶中,加二次纯化水稀释并定容至刻度,得浓度为40.2 μg·mL-1的对照品溶液。

图4 当归的薄层色谱图

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2.2.2.2 供试品溶液的配制 取花芪颗粒适量(批号: 121126),研细,称取约12 g,精密称定,置锥形瓶中,加入甲醇50 mL,称定质量,加热回流1.5 h,放冷,再称定质量,用甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过,精密量取续滤液10 mL,蒸干,残渣用二次纯化水溶解,转移至10 mL量瓶中,用二次纯化水稀释至刻度,摇匀,即得供试品溶液。进样前过筛孔内径0.45 μm微孔滤膜。

2.2.2.3 阴性对照溶液的配制 取处方比例不含生地的各成分,按花芪颗粒制备工艺制成阴性颗粒样品,照供试品溶液的方法制备阴性对照溶液,备用。

2.2.3 专属性考察 分别精密吸取空白溶剂及“2.2.2”项下对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品溶液各10 μL,分别注入高效液相色谱仪中,进行测定,记录色谱图(图5)。结果表明:运用此法测定梓醇含量时基线噪音小,阴性无干扰,专属性强;且理论板数实际计算值为10 667,符合要求。

2.2.4 线性关系考察 分别精密吸取“2.2.2.1”项下梓醇对照品溶液(40.2 μg·mL-1)6,8,10,12,14, 18 μL注入高效液相色谱仪中,进行测定,以峰面积(Y)对梓醇的进样量(X)进行线性回归,得Y= 21 320X-248.8,r=0.999 8;结果显示梓醇进样量在0.241～0.724 μg范围内呈良好的线性关系。

2.2.5 精密度实验 精密吸取同一浓度的对照品溶液,按“2.2.1”项下的色谱条件,连续进样5次,每次10 μL,记录峰面积并计算其RSD,结果RSD为0.56%,精密度良好。

2.2.6 重复性实验 取同一批(批号:121126)的花芪颗粒样品,按“2.2.2.2”项方法,分别制备5份供试品溶液,按“2.2.1”项色谱条件进样10 μL测定,测得梓醇含量平均值为0.21 mg·g-1,RSD为0.14%。

2.2.7 稳定性实验 取“2.2.2.2”项供试品溶液,按“2.2.1”项色谱条件进样分析,在0,2,4,6,8 h内进样5次,记录峰面积,计算得RSD为0.22%,表明供试品溶液在8 h内基本稳定。

2.2.8 加样回收率实验 取已知含量的花芪颗粒(批号:121126)适量,研细,称取约6 g,精密称定,分别精密加入梓醇对照品储备液(浓度0.402 mg·mL-1)2.5,3.1,3.7 mL,加甲醇至50 mL,称定质量,按“2.2.2.2”项方法制备供试品溶液,按“2.2.1”项色谱条件进样10 μL测定,计算加样回收率,结果见表1。结果表明:本方法的准确度较好,平均回收率为95.19%,RSD为3.20%。

图5 4种溶液的高效液相色谱图

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表1 梓醇加样回收率实验结果 n=9

2.2.9 样品含量测定 取3批样品(批号:121126, 130119,130305),按“2.2.2.2”项下方法制备供试品溶液各两份,按“2.2.1”项色谱条件进样10 μL测定,结果见表2。

表2 3批样品中梓醇含量测定结果 mg·g-1

3 讨论

花芪颗粒由多味中药组成,成分较复杂,笔者通过参考文献及多次实验最终筛选出黄芪[3-8]、生地[8-9]、麦冬[5,8,10-11]和当归[6-9,12]4味药材的提取方法及层析系统,对其进行鉴别。结果表明,各特征斑点清晰,阴性无干扰,可作为本制剂的定性检测。麦冬的薄层色谱图中,对照药材有4个斑点,而样品中只有两个,可能是由于制剂在制备过程中被提取入药成分较少。

文献报道测定中成药(颗粒剂、煎剂和冲剂等)中梓醇含量时,采用的提取溶剂有双蒸水、甲醇、75%乙醇等;提取方法有超声提取,回流提取[13-17]。在本实验研究中考察不同溶剂,不同提取方法及不同提取时间对梓醇提取效果的影响,发现药物中辅料对本品的提取影响较大,最终确定以甲醇为溶剂,加热回流1.5 h为提取方法。

梓醇为环烯醚萜苷类化合物,易溶于水、甲醇,在波长210 nm处有最大吸收,考虑到甲醇作为溶剂时的末端吸收[13],选择二次纯化水作为对照品的溶解溶剂,且在供试品的制备过程中,将甲醇蒸干,用二次纯化水复溶,以减少甲醇末端吸收带来的影响。同时,本实验考察了不同流动相对梓醇测定峰形的影响。结果显示乙腈-0.1%磷酸溶液(0.5∶99.5)作为流动相时梓醇的分离度好,峰形稳定,故最终选择其作为流动相。

通过本实验建立的薄层色谱法和高效液相色谱法对本制剂进行3批样品的质量控制,结果表明该方法简便、稳定、可靠,可作为该制剂的质量控制标准。

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DOI 10.3870/yydb.2014.10.035

R286;R927.2

B

1004-0781(2014)10-1381-04

2013-09-04

2013-11-19

*军队医疗机构制剂标准提高计划(13ZJZ08)

王莹(1988-),女,陕西延安人,硕士,从事中药分析技术研究。电话:029-84773998,E-mail:wangying880913@ 126.com。

王晓娟(1962-),女,陕西咸阳人,主任药师,硕士生导师,从事天然药物化学与中药新制剂研究。电话:029-84776189,E-mail:wxjyh231@fmmu.edu.cn。