rAAV1-SERCA2a转染改善心力衰竭犬心功能及其机制探讨*

米亚非，李小鹰，江建军，付治卿，鲁晓春

(1温州医科大学附属台州医院心内科，浙江台州 317000;2解放军总医院老年心血管病一科，北京 100853)

rAAV1-SERCA2a转染改善心力衰竭犬心功能及其机制探讨*

米亚非1，李小鹰2△，江建军1，付治卿2，鲁晓春2

(1温州医科大学附属台州医院心内科，浙江台州 317000;2解放军总医院老年心血管病一科，北京 100853)

目的:研究重组1型腺相关病毒(rAAV1)介导的肌浆/内质网Ca2+-ATP酶2a(SERCA2a)基因转移对心力衰竭(HF)犬心功能的作用并探讨其机制。方法：采用快速右心室起搏建立比格犬的HF模型，设对照组、HF组、HF+EGFP组和HF+SERCA2a组(均n=4)。后2组经开胸心肌内注射rAAV1-EGFP或rAAV1-SERCA2a，剂量为1×1012病毒基因组。结果:基因转移30 d后，HF+SERCA2a组超声心动图左室射血分数接近对照组，较HF组明显改善(P＜0.05)，SERCA2a mRNA较HF组显著提高(P＜0.05)，SERCA2a蛋白在心肌组织中的表达显著高于HF组(P＜0.05)，心肌细胞凋亡指数和基质金属蛋白酶9(MMP-9)表达较HF组显著降低(P＜0.05)。HF+EGFP组各项观察指标接近HF组。但是，受磷蛋白mRNA的水平没有改变。结论:rAAV1-SERCA2a转染上调HF犬心肌组织SERCA2a的表达，能改善心功能，抑制心室重塑;其机制可能与抑制心肌细胞凋亡、下调MMP-9表达有关。

心力衰竭;快速右心室起搏;肌浆/内质网Ca2+-ATP酶2a;腺相关病毒

心力衰竭(heart failure，HF)在细胞水平的特征是收缩功能的损害和Ca2+稳态的失衡。Ca2+调节不仅决定着心肌收缩，影响心率变化，还对心力衰竭进展过程中的心脏肥厚、重构发挥重要作用，Ca2+调节处于心力衰竭病理生理的中心环节［1］。研究证明，细胞膜和肌浆网膜上几个与心肌浆/内细胞内钙调节密切相关的分子在心衰的发病过程中发挥了重要的作用［2-3］。肌浆/内质网Ca2+-ATP酶(sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase，SERCA)位于肌浆网膜上，能将Ca2+从细胞质重摄取入肌浆网腔内，是细胞内Ca2+调节的关键酶［4］。SERCA已经分离出了5种亚型，在正常和衰竭心脏中表达的主要是2a亚型(即心脏/慢动作骨骼肌型)。本实验通过重组1型腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus type 1，rAAV1)介导SERCA2a基因转染，纠正心力衰竭比格犬心肌细胞Ca2+调节的紊乱，观察对心力衰竭比格犬心功能及心室重构的影响，通过观察心肌细胞的凋亡情况和基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)的表达，探索SERCA2a作用的机制，为SERCA2a临床应用提供依据。

材料和方法

1 动物

健康比格犬18只，体重9～12 kg，雌雄各半，解放军总医院实验动物中心提供。

2 主要试剂和仪器

携带SERCA2a的rAAV1(rAAV1-SERCA2a)和携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)的rAAV1(rAAV1-EGFP)均由北京本元正阳基因技术股份有限公司包装，病毒滴度均为1 ×1015viral genomes/L。MMP-9多克隆抗体为Santa Cruz产品;兔多克隆SERCA2a抗体购自Lab Vision; TUNEL试剂盒为Promega产品;山羊抗兔SP检测试剂盒、辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG均为中杉公司产品。埋藏式VOO固定高频率起搏器为上海复旦大学电子工程系研制，起搏频率设有230 beats/min和180 beats/min;起搏电极为Medtronic生产;C型臂X线数字减影机为飞利浦产品;心脏彩色超声心动图为通用电器公司产品。

3 主要方法

3.1 比格犬心力衰竭模型的建立术前12 h禁食，用3%戊巴比妥钠按25 mg/kg静脉麻醉。分离出右颈外静脉，在X线引导下将电极送至右室心尖。在颈部做一皮囊，置入起搏器，暂停起搏。3 d后通过磁铁在体外启动起搏器，起搏器固定频率230 beats/ min，持续30 d后。再行手术换频率180 beats/min的起搏器，再持续30 d。术中和术后3 d给予青霉素80 U预防感染。

3.2 基因转染更换起搏频率为180 beats/min的起搏器时，手术动物每只注射rAAV1-EGFP或rAAV1-SERCA2a病毒液1 mL。麻醉方法同前，呼吸机支持呼吸。经第4肋间进入胸腔，于左室前壁的左冠状动脉前降支与左冠状动脉回旋支之间区域选择注射点，垂直进针3～5 mm，共选取共10个点依次注射药液。

3.3 超声心动图清醒状态的比格犬，左胸前区备皮，仰卧于检查台上，停止起搏30 min后进行超声心动图检查，指标有左室收缩期内径(left ventricular diameter during systole，LVSD)、左室舒张期内径(left ventricular diameter during diastole，LVDD)、左室后壁厚度(leftventricularposteriorwalldimension，LVPWD)、射血分数(ejection fraction，EF)等。

3.4 mRNA检测基因治疗30 d后处死动物，取左心室前壁心肌组织用于检测SERCA2a和受磷蛋白(phospholamban，PLN)mRNA的表达。

3.4.1 RT-PCR检测心肌组织中SERCA2a mRNA的表达提取组织中总RNA并取RNA 5 μg进行逆转录，取逆转录产物2 μL进行PCR反应。以GAPDH为内参照。SERCA2a上游引物5’-CAGCTGCTCTGGGTCAATC-3’，下游引物5’-CAGGTTCCAGGTAGTTGCG-3’，扩增片段长度为613 bp。GAPDH上游引物5’-GATGCTGGTGCTGAGTATGT-3’，下游引物5’-CTTCTGGGTGGCAGTGAT-3’，扩增片段长度为294 bp。PCR反应体系25 μL，反应条件为:94℃5 min，变性，94℃30 s，57.4℃30 s，72℃30 s，72℃7 min，共30个循环。

3.4.2 RT-PCR检测组织中PLN mRNA的表达PLN上游引物5’-CAAGCACGTCAAAATCTTCAGA-3’，下游引物5’-CTGGTTAGCAGAGCAGTTTTAAAA-3’，扩增片段长度为438 bp。PCR反应体系25 μL，反应条件为:94℃5 min变性，94℃30 s，51.2℃30 s，72℃30 s，72℃7 min，共30个循环。取5 μL延伸PCR产物，1.5%琼脂糖凝胶电泳后进行计算机图像分析。

3.5 电镜检查取1 mm×1 mm×1 mm心肌组织2～3块，6%戊二醛固定后依次梯度乙醇脱水，环氧树脂包埋，制成超薄组织切片，在电子显微镜下，观察心肌组织超微结构变化，选取典型视野拍照。

3.6 组织中SERCA2a和MMP-9免疫组织化学染色

组织用4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，石蜡包埋切片，具体按SP试剂说明书操作。胞浆棕黄色或棕褐色为阳性。采用Leica Qwin图像分析软件计算20个高倍视野的吸光度和积分吸光度值。

3.7 心肌细胞凋亡指数检测固定心肌组织后制成组织切片，用TUNEL试剂盒检测。染色后普通光学显微镜下(×400)观察，每张切片观察5个视野，计数阳性细胞数，计算凋亡指数，取其平均值。凋亡指数(%)=凋亡细胞数/细胞指数×100%。

4 统计学处理

使用SPSS 18.0统计软件分析。数据以均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

18只比格犬中，1只比格犬在快速起搏(230 beats/min)30 d后猝死，1只比格犬在30 d后更换起搏器和基因转染后死于严重心衰。16只比格犬完成整个实验过程。快速右心室起搏(230 beats/min)30 d后，全部犬均出现活动能力下降、剩食、气促、腹胀等明显的心衰表现。更换频率起搏器(180 beats/ min)后将16只比格犬随机分为4个组:(1)对照组4只;(2)HF组4只;(3)HF+EGFP组4只;(4) HF+SERCA2a组4只。

1 超声心动图结果

基因转染30 d后，HF组和HF+EGFP组的LVDD、LVSD和LVPWD较对照组和HF+SERCA2a组显著增高，EF较对照组和HF+SERCA2a组显著降低(P＜0.05)，说明HF组和HF+EGFP组比格犬心脏收缩功能明显受损;HF+SERCA2a组的LVDD、LVSD和LVPWD较对照组增高，EF较对照组降低，但差异未达到统计学意义(P＞0.05)，说明HF+SERCA2a组心脏收缩功能受损不显著，见表1。

表1 基因转染30 d后各组比格犬超声心动图指标Table 1.Echocardiographic data in each group 30 days after gene transfer(Mean±SD.n=4)

2 心肌组织SERCA2a mRNA的表达

RT-PCR发现，各组心肌组织均见610 bp的条带。对心肌组织的SERCA2a mRNA的表达进行半定量分析，HF组和HF+EGFP组的SERCA2a mRNA表达与对照组相比显著降低(P＜0.05)，HF+SERCA2a组与HF组相比显著增高(P＜0.05)，接近对照组水平，见图1。

3 心肌组织PLN mRNA的表达

RT-PCR发现，各组心肌组织均见430 bp的条带。对心肌组织的PLN mRNA表达进行半定量分析，对照组、HF组、HF+EGFP组和HF+SERCA2a 组PLN的表达没有显著差异(P＞0.05)，见图2。

4 电镜下超微结构变化

对照组心肌纤维完整，横纹肌结构清晰，Z线清楚，线粒体结构完好无肿胀，嵴突完好，闰盘结构清晰完好;HF组和HF+EGFP组电镜下心肌纤维呈变性改变，肌丝片状溶解、断裂、排列紊乱、水肿，线粒体膨胀，呈气球样变，嵴稀疏，部分嵴突消失，空泡化多见，肌浆网扩张，Z线融合，闰盘解离多见;HF+ SERCA2a组肌丝片状溶解、断裂、排列紊乱，但程度较HF组、HF+EGFP组减轻，见图3。

Figure 3.Cardiomyocytes examined by electron microscopy.A: myocardial fibers and Z lines orderly distributed in control group(×25 000);B:part Z lines aggregated and patchy myocardial fibers dissolved or fractured in HF group(×10 000);C:patchy myocardial fibers dissolved in HF+EGFP group(×40 000);D:myocardial fibers and Z lines orderly distributed in HF+ SERCA2a group(×12 000).图3 心肌细胞电镜观察

5 心肌组织中SERCA2a的表达

SERCA2a主要表达于心肌细胞的胞浆，呈棕黄色，在心肌组织内弥漫分布，纤维细胞及血管内皮细胞未见表达，见图4;其它组织(肝脏、肺脏)未见SERCA2a表达。对各组比格犬的心肌组织SERCA2a的表达进行半定量分析发现，HF组(吸光度值为0.8744±0.0432，积分吸光度值为31.176±3.354)和HF+EGFP组(吸光度值为0.8768±0.0417，积分吸光度值为31.697±3.146)与对照组(吸光度值为1.0539±0.0486，积分吸光度值为34.563± 2.926)比较显著降低(P＜0.05)。HF+SERCA2a组心肌细胞的SERCA2a表达(吸光度值为1.1758± 0.0387，积分吸光度值为38.684±3.358)较对照组显著增高(P＜0.05)，也显著高于HF组与HF+EGFP组(P＜0.05)。

Figure 4.SERCA2a diffusely expressed in myocardial tissues (SP，×200).A:control;B:HF;C:HF+EGFP; D:HF+SERCA2a.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs SERCA2a group.图4 SERCA2a在心肌组织中的表达

6 心肌细胞凋亡改变

通过TUNEL试剂盒检测发现，心肌细胞发生凋亡后，细胞核呈棕褐色，胞核呈椭圆形或圆形，胞浆淡染，在心肌组织内呈散在分布。非凋亡心肌细胞的细胞核被苏木素染呈深蓝色，细胞核呈长椭圆形或杆状，见图5。对照组比格犬的心肌细胞未见凋亡细胞。HF组及HF+EGPF组见散在的凋亡心肌细胞，凋亡指数分别为(4.56±0.29)%和(4.21± 0.31)%，均较对照组显著增高。HF+SERCA2a组心肌细胞的凋亡指数为(1.47±0.13)%，较HF组和HF+EGFP组显著降低(P＜0.01)。

7 心肌组织MMP-9免疫组织化学染色

MMP-9主要表达于心肌细胞的胞浆，呈棕黄色，散在分布或小片状表达，见图6。采用Leica Qwin图像分析软件对各组比格犬的心肌组织MMP-9表达进行半定量分析，计算20个高倍视野的吸光度和积分吸光度，发现HF组MMP-9(吸光度值为0.3147 ±0.0079，积分吸光度值为4.354±0.142)和HF+ EGFP组(吸光度值为0.3082±0.0075，积分吸光度值为4.276±0.139)显著高于对照组(吸光度值为0.0346±0.0013，积分吸光度值为0.145±0.027) (P＜0.01)。HF+SERCA2a组心肌细胞的MMP-9表达(吸光度值为0.1365±0.0045，积分吸光度值为1.941±0.093)较对照组显著增高(P＜0.05)，但较HF组、HF+EGFP组显著降低(P＜0.05)。

Figure 5.Apoptotic index of the myocardial tissues(TUNEL，×200).A:control;B:HF;C:HF+EGFP;D:HF +SERCA2a.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs SERCA2a group.图5 凋亡的心肌细胞

Figure 6.Expression of MMP-9 in myocardial tissues(SP，×400).A:control;B:HF;C:HF+EGFP;D:HF +SERCA2a.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs SERCA2a group.图6 心肌组织MMP-9蛋白的表达

讨论

左心室功能不全或心力衰竭时，心脏结构和功能发生进行性损害，均表现为心脏重构，组织学上可见心肌细胞凋亡、细胞外胶原沉积和基因/细胞因子活化的增加。多种因素可导致心脏重构，其基本过程表现为Ca2+稳态失衡，Ca2+信号通路激活，心肌细胞肥大和结构变化，Ca2+调节的改变是心力衰竭发展的必然通路［5］。有研究表明，静息期Ca2+持久升高可激活丝/苏氨酸磷酸化酶而诱导心肌肥厚，促进细胞凋亡。降低舒张期胞内Ca2+浓度不仅有益于收缩性，而且能减少磷酸化酶激活，阻断细胞凋亡和心肌肥厚的发生［6］。过表达SERCA2a通过增加肌浆网摄取和Ca2+的释放，降低舒张期胞内Ca2+浓度，成为减缓心室重构发生的重要途径［7］。

本实验结果发现，SERCA2a基因转染30 d后，左室EF较HF组和HF+EGFP组显著升高，LVDD 和LVSD较HF组和HF+EGFP组显著下降，相关的血流动力学改变见前期实验［8］，表明SERCA2a基因治疗能改善心肌收缩，减缓心脏重构。

SERCA2a基因转染后，经RT-PCR和免疫组化均发现，在HF+SERCA2a组，心肌的SERCA2a表达显著高于HF组和HF+EGFP组，提示外源基因在心肌组织中获得了表达。电镜观察HF组心肌纤维呈变性改变，肌丝片状溶解、断裂、排列紊乱、水肿，线粒体膨胀，呈气球样变，肌丝间的间隙增宽，肌浆网扩张，Z线融合，闰盘解离多见。SERCA2a基因转染组心肌纤维完整，Z线清楚，线粒体结构完好、无肿胀，嵴突完好，闰盘结构清晰，说明SERCA2a基因治疗能改善心肌病变程度。TUNEL法检测发现，在HF组和HF+EGFP组，凋亡指数与对照组相比显著增加(P＜0.05);而在SERCA2a基因治疗30 d组，凋亡指数与HF组和HF+EGFP组相比显著减少(P＜0.05)。提示SERCA2a转染可能抑制心肌细胞凋亡。

钙泵的活性除主要受SERCA2a表达程度影响外，还与一些调节因子的表达密切相关，其中PLN对SERCA功能调节作用最为重要。非磷酸化的PLN 与SERCA结合，通过蛋白-蛋白之间的相互作用，抑制钙泵与Ca2+的亲和力，降低ATP酶的活性;磷酸化的PLN与SERCA解离，减轻对SERCA的抑制，导致SERCA的Ca2+转运速率增加。SERCA蛋白的活化程度则取决于PLN数量和磷酸化程度，PLN/ SERCA2a比值与心肌的收缩力呈负相关［9］。本实验结果显示，PLN mRNA表达水平在HF组、HF+EGFP组、HF+SERCA2a组及对照组之间无显著差异，与Beeri等［10］和Jiang等［11］的报道一致。尽管PLN没有发现显著改变，但随着SERCA2a水平升高，PLN/ SERCA2a比值下降，心肌收缩力提高。

心肌基质金属蛋白酶活性改变与左室扩张、心室重构密切相关，特别是MMP-9在缺血和非缺血扩张心肌病大量增加，在心力衰竭引起的心室重构中的作用受到日益关注。本实验结果发现，在快速起搏所致的心力衰竭组，心肌组织MMP-9表达显著强于对照组，SERCA2a基因治疗30 d组，MMP-9表达较心衰组明显减弱，说明将SERCA2a基因在心肌局部过表达除改善心力衰竭症状外，还可通过减少MMP-9的表达，延缓心衰进程中心室重构的进展。

综上所述，本实验在大动物模型上，通过基因转染，上调心肌细胞SERCA2a的表达，能够改善心脏功能，抑制心室重塑，并对其发生机理进行了初步探讨。SERCA2a基因转导治疗晚期心力衰竭的I、II期临床试验中取得了较好的效果［12-13］，进一步在大动物模型中探索有效的基因转染方法，研究其改善心脏功能，减缓心室重构的机制，将为SERCA2a基因转导治疗晚期心力衰竭在临床的早日应用提供理论基础，为提高治疗效果、减少临床风险提供新的思路或方法。

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Transfection of rAAV1-SERCA2a improves cardiac function of beagles with heart failure

MI Ya-fei1，LI Xiao-ying2，JIANG Jian-jun1，FU Zhi-qing2，LU Xiao-chun2
(1Department of Cardiology，Taizhou Hospital，Wenzhou Medical University，Taizhou 317000，China;2First Department of Geriatric Cardiology，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China.E-mail:xyli301@163.com)

AIM:To study the effects of recombinant adeno-associated virus type 1(rAAV1)-sarcoplasmic/ endoplasmic reticulum calcium ATPase 2a(SERCA2a)transfection on the cardiac function of beagles with heart failure (HF).METHODS:The beagles were used to make an animal model with heart failure after rapid right ventricular pacing (230 beats/min)for 30 d.A reduced rate(180 beats/min)was continuously applied for another 30 d.The beagles were divided into 4 groups(n=4):control group，HF group，HF+EGFP group and HF+SERCA2a group.rAAV1-EGFP and rAAV1-SERCA2a(both 1×1012viral genomes)were intramyocardially injected into the animals in the latter 2 groups，respectively.RESULTS:After transfection for 30 d，the left ventricular systolic function in HF+SERCA2a group was similar to that in control group，and significantly higher than that in HF group(P＜0.05).The ratio of SERCA2a mRNA/ GAPDH mRNA was significantly higher in HF+SERCA2a group than that in HF group(P＜0.05).The expression level of SERCA2a in the myocardial tissues was higher in HF+SERCA2a group than that in HF group(P＜0.05).The apoptotic index of the cardiomyocytes and the protein expression of MMP-9 were much lower in HF+SERCA2a group than those in HF group(P＜0.05).No significant difference of all parameters was observed between HF group and HF+EGFP group.The mRNA level of phospholamban was unchanged.CONCLUSION:Transfection of SERCA2a improves the expression of SERCA2a，restores the cardiac function and inhibits left ventricular remodeling by reducing the cardiac cell apoptosis and the MMP-9 expression in the heart failure beagles.

Heart failure;Rapid right ventricular pacing;Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase 2a;Adeno-associated virus

R541.61

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.003

1000-4718(2014)02-0208-06

2013-07-24

2013-12-23

国家重点基础研究发展计划(973计划)(No.2006CB503806)

△通讯作者Tel:010-66876231;E-mail:xyli301@163.com