拮抗细菌Y13对油茶炭疽病防治试验

高月庭，周国英*，何小勇，王明月

（1. 中南林业科技大学 经济林培育与保护教育部重点实验室，湖南 长沙 410004；2. 浙江省丽水市林业科学研究院研究生工作站，浙江 丽水 323000；3. 浙江省丽水市林业有害生物防治检疫总站，浙江 丽水 323000）

拮抗细菌Y13对油茶炭疽病防治试验

高月庭1，周国英1*，何小勇2，王明月3

（1. 中南林业科技大学 经济林培育与保护教育部重点实验室，湖南 长沙 410004；2. 浙江省丽水市林业科学研究院研究生工作站，浙江 丽水 323000；3. 浙江省丽水市林业有害生物防治检疫总站，浙江 丽水 323000）

通过设计2个单因素试验，以施用浓度和施用时间为因素，分别选取3个水平，以防治效果、严重度和Y13对生长影响作为指标，进行单因素方差分析的多重比较。结果表明，两组单因素实验对油茶成林炭疽病均起到了良好的防治效果；当Y13浓度达到1010cfu/mL时，防治效果最高，炭疽病的严重度最低，叶片生长量最高；4月和6月同时施用使生防效果达到最优，可见高浓度和多次数施用是防治成林炭疽病重要的影响因子。

油茶炭疽病；内生拮抗细菌；生物防效；影响因子

油茶（Camellia oleifera）是我国南方特有的食用油料树种，亦是世界四大木本油料树种之一[1]，已有2 000多年的栽培历史。它抗逆性强，适应性广，以湖南、浙江、江西、广西为主，适种于广大的红壤丘陵低地区。油茶炭疽病（Anthracnose）是油茶常见病害之一，在我国油茶产区普遍发生，引起严重落果、落蕾、落叶、枝枯，甚至整株衰亡[2]。据调查，浙江省油茶炭疽病严重病区发病率高达 80%，病树的平均存果率比无病树降低了63.3%，造成严重的经济损失[3]。因此，提高油茶炭疽病的防治技术，特别是探索生物防治技术，是油茶生产的当务之急。

Y13是由中南林业科技大学经济林培育与保护教育部重点实验室从健康油茶叶片中分离筛选的拮抗细菌，经鉴定为枯草芽孢杆菌，对油茶炭疽病的平板抑菌率达到84.1%[4]，盆栽试验防治效果也达到了77.23%[5]，具有十分广阔的应用前景。本实验拟对影响该菌株的生物防效的二种重要因素进行林间试验，探究在自然微生态环境下Y13对油茶炭疽病的影响。

1 材料与方法

1.1 供试菌株及其培养

1.1.1 供试菌株 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Y13，由中南林业科技大学教育部经济林培育与保护实验室提供。

1.1.2 供试培养基 NA培养基：牛肉膏1.2 g，蛋白胨4.0 g，NaCl 2 g，琼脂20 g，水1 000 mL；Y13最大抑菌活性培养基：葡萄糖25 g，酵母膏10g，牛肉膏 28g，NaCl 1.2%，水1 000 mL；Y13最大生长量培养基：葡萄糖25 g，酵母膏10 g，牛肉膏3 g，NaCl 1.5%，水1 000 mL。

1.1.3 拮抗菌Y13施用原液的配置 Y13用NA培养基将菌种活化后，采用Y13最大抑菌活性培养基做一级种子发酵液，再用Y13最大生长量培养基做二级种子发酵液，之后继续扩繁。平板对峙实验抑菌率达到88%。亚甲基蓝（国产生物染色剂）染色后，用血小板计数法测量原液中孢子数量，目测显微镜视野中80 ~ 100个孢子，基本达到1010cfu/mL，其它浓度按相应比例用无菌水稀释10倍，100倍备用。

1.1.4 Y13喷施菌剂抑菌率测定 将配好的喷施液于备用的炭疽病病原菌做平板对峙实验，测定抑菌圈的大小，得出抑菌率达到84%。

1.2 试验处理

1.2.1 浓度试验处理 研究在浙江省松阳县象溪镇下了儿村（28°45′ N，119°48′ E）设置不同浓度Y13防控试验。该地海拔430 m，位于南坡，坡度30°，油茶林龄30 ~ 40 a，往年有油茶炭疽病发生。试验随机设3个处理1个对照，每处理面积20 m×20 m，中间设置隔离带2 m。每个处理喷施不同浓度的Y13原液，分别为A1（喷施108cfu/mL)，A2（喷施109cfu/mL），A3（喷施1010cfu/mL），ck（清水对照）。每个处理重复3次。根据处理浓度，将配置好的Y13原液用农用型喷雾器喷洒整株油茶至叶片滴水。4月和6月各喷施一次，每次喷施后，间隔25 d再喷一次进行药效加强。其他抚育措施均按常规处理。

1.2.2 时间试验处理 研究在浙江省遂昌县三仁乡排前村（28°43′ N，119°63′ E）设置不同时间Y13防控试验，该地海拔396 m，位于南坡，坡度33°，油茶林龄30 ~ 40 a，往年有油茶炭疽病发生。试验随机设3个处理1个对照，每处理面积20 m×20 m，中间设置隔离带2 m，四角定桩用红绳圈定。每个处理在不同时间喷施1010cfu/mL浓度的Y13原液。分别为分别B1（4月下旬喷施），B2（6月下旬喷施），B3（4月下旬和6月下旬各喷施1次），ck（清水对照）。每个处理重复3次。根据处理时间，将配置好的1010cfu/mL的Y13原液用农用型喷雾器喷洒整株油茶至叶片滴水。每次喷施后，间隔25 d再喷1次进行药效加强。其他抚育措施均按常规处理。

1.3 生物防效调查

1.3.1 采样调查 于10月中旬每个样方对角线随机选取3株油茶树，每株树东南西北随机抽取15 ~ 20 cm的新抽枝条，收集所有油茶叶片。

1.3.2 防治效果测定方法 采集叶片后，用MRS-9600TFU2L Scan Maker进行扫描，对已收集的数据选用DTOPSIS法综合评价实验油茶的病情指数[3]。根据林业行业对于植株防治效果的测定标准，计算防治效果，防效 =（对照病情指数－处理病情指数）/对照病情指数×100%。

1.3.3 病害严重度的测量 对已收集的数据采用 LA-S系列植物图像分析仪系统统计叶片总面积和叶片病斑面积。病害严重度为（发病叶片病斑总面积/发病叶片总面积）×100%

1.3.4 新叶生长量的测量 经分析仪系统将采集到的新叶片面积计算加和。

1.4 数据处理

大数据将人与物、物与物关联，新技术则给内容提供更优势的供给，运用AR（Augmented Reality ）增强现实技术可以将传统的方言传播转化为参与式传播与沉浸式传播，用户以方言文化作为共同属性出发，建立共有社交情景，在人与信息之间进行价值转换，直至形成关系闭环。因此，结合大数据和以AR为代表的前沿技术可分析得出方言传播机制渐进层次（见图1），为方言传播拓展新维度、提出新范式提供有效依据。

以防治效果、病害严重度以及植株新叶生长量作为指标，采用Microsoft Excel 2003整理，用SPSS19.0软件进行一般线性模型单因素处理，方差分析采用单因素新复极差法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同浓度Y13对油茶成林炭疽病的防控效果

由表1可知，在防治效果这一检验指标中，3个浓度在P = 0.01水平呈极显著差异。3种喷施浓度都对油茶成林炭疽病起到了明显的抑制作用，且防治效果随浓度的升高而逐渐增加。当浓度为1010cfu/mL时，防治效果达到最高，均值为56.21%。

表1 不同浓度Y13对油茶成林炭疽病的防控效果比较

以病害严重度作为指标，3个浓度在P = 0.01水平中A3与A1、A2呈极显著差异，A1与A2无差异。不同施用浓度的处理均对油茶成林炭疽病起到了一定的抑制作用。浓度越高，病害的严重度越低。当浓度为1010cfu/mL时，严重度达到最低，均值为34%。而A1、A2与ck并不存在差异，说明108、109cfu/mL这2种浓度并未对炭疽病的严重度起到太大的效果，可能是由于浓度较低的Y13不利于微生物的定殖，因此没有发挥其拮抗的抑制作用。

以新叶生长量为检验指标，3个浓度在P = 0.01水平A1、A2与A3呈极显著差异，A1、A2、CK无差异。总体来看浓度越高，新叶总面积越大。当浓度为1010cfu/mL时，新叶总面积达到最高。由此说明高浓度的枯草芽孢杆菌对植物的生长有一定的影响能力。

综上所述，3个指标结果一致，1010cfu/mL这一浓度对Y13防治油茶成林炭疽病起到了较好的防治效果。

2.2 不同的施用时间Y13对油茶成林炭疽病的影响

表2 不同的施用时间Y13防治油茶炭疽病效果比较

以病害严重度作为指标显示，在不同时间施用1010cfu/mL的Y13对炭疽病严重度的影响在P = 0.05水平存在显著差异，3个时间水平中B3与B2、B1达到显著差异，B1与B2、ck间无差异。说明两月共同施用的效果明显好于单月喷施，能够使炭疽病的严重度降低。而4月施用与对照相比，严重度降低的最少。在P = 0.01水平下，3个时间无差异。

新叶生长量这一检验指标中显示，在P = 0.05水平B1、B2、CK与B3存在显著差异（Sig = 0.046＜0.05），而P = 0.01无显著差异。说明单月施用Y13对油茶生长状况的影响并不是很大。这可能是由于双月施用能够使枯草芽孢杆菌的定殖能力增强，从而有效的在油茶叶片上繁殖。

综上所述，3个检验指标结果一致，5月和7月是油茶炭疽病爆发的高峰期，在两次爆发前都使用生防菌，总体效果要优于单次使用。

3 讨论

枯草芽孢杆菌在自然界中广泛存在，对人畜无毒无害，不污染环境，能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力[6]。Y13是油茶内生拮抗细菌，实验室盆栽防治油茶炭疽病有很好的效果，也具有一定的广谱性[5]。本实验设计了两个单因素的林间成林实验，目的是要探求该拮抗菌在自然微生态环境下，对于发病严重老林的生物防治效果。

生物均具有一定的生态适应性。在一定生态系中引入生防菌，它能否适应其被引入的生态环境，能否在病菌的寄主植物上定殖、增殖以及与相应病原物竞争决定着生物防治的成败，这些都与生防菌的定殖和生物学特性紧密相关[7]。由于油茶苗木的叶片和油茶成林叶片的微生态环境不同，可能会造成Y13定殖、抑菌过程的不同，因此反应出的效果也不同。

施用浓度和施用时间是病害生物防治的两个关键因素，由上述结果反应，两个因素对Y13防治油茶炭疽病的生物效果各自表现出不同的差异。当Y13浓度达到 1010cfu/mL时，防治效果最高，炭疽病的严重度最低，叶片生长量最高。4月和6月组合施用也使生防效果达到最优。时间因素并未在叶片生长量这一指标表现差异，可能是与枯草芽孢杆菌的定殖能力有关。生防枯草芽孢杆菌能促进植物根系及植株生长，增强了植物的抗病性,从而间接地减少病害发生[8]。由于本试验选择的样地是油茶老林，其微生物种群相对很丰富，有可能阻碍Y13的定殖能力，因此并未在叶片生长表现作用。

据报道，在国外Selim Dedej为了达到良好的防治效果，还经常利用授粉昆虫传播生物农药，经过3 a田间试验，利用蜜蜂传播Serenade粉剂防治美国越橘病害和进行授粉达到两重功效，取得了不错的生物防治效果[9]。因此继续探索生防因子是否适应并在自然微生态环境下发挥其拮抗与抑制病害的作用仍然需要我们研究。

本人认为该次实验能够脱离实验室，可以在复杂的自然环境下测试Y13防治油茶成林炭疽病的生物防控能力，能够为Y13生物菌剂继续走向产业化提供一些证实和依据。

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Experiment on Prevention and Control of Anthracnose in Adult Camellia oleifera Stand by Y13

GAO Yue-ting1，ZHOU Guo-ying1*，HE Xiao-yong2，WANG Ming-yue3
（1. Key Laboratory of the Ministry of Education for Economic Forestry Cultivation and Protection, Central South University of Forestry &Technology, Changsha 410004, China; 2. The Graduate Workstation of Lishui Acadmy of Forestry, Lishui 323000, China; 3. Lishui Forest Pest Control and Quarantine Station , Lishui, 323000, China）

Experiment of stands in Songyang and Suichang of Zhejiang tow single factor on prevention and control of Antagonistic endophytic Bacteria Y13 to anthracnose were conducted at adult Camellia oleifera. The results showed that this two single factors played a good role on bio-control of anthracnose. When the concentration up to 1010cfu/mL, Y13 showed the best control effect. And spraying in April and June showed the same bio-control effect. The experiment resulted that high concentration and were the impact bio-control factors.

anthracnose; endophytic antagonist bacteria; biological control; impact factors

S763.1

A

1001-3776（2014）02-0014-04

2013-09-09；

2014-02-18

高月庭（1986－），女，河北张家口人，硕士生，从事森林保护应用微生物研究；*通讯作者。