不同产区龙井茶相似性及线性判别

王丽鸳，成 浩*，贺 巍，韦 康，张成才

（1. 中国农业科学院茶叶研究所国家茶树改良中心，浙江 杭州 310008；2. 河南农业大学园艺学院，河南 郑州 450002）

不同产区龙井茶相似性及线性判别

王丽鸳1，成 浩1*，贺 巍2，韦 康1，张成才1

（1. 中国农业科学院茶叶研究所国家茶树改良中心，浙江 杭州 310008；2. 河南农业大学园艺学院，河南 郑州 450002）

对来自西湖龙井一级保护区、西湖龙井二级保护区、钱塘产区、越州产区4个产区的527份龙井茶样品进行了高效液相色谱测定和主成分分析及线性判别，结果表明：不同产区的龙井茶在儿茶素等酚性物质及咖啡碱含量上没有显著性差异；通过主成分分析，提炼出5个主成分，其中第一主成分构成中影响较大的因子有EGCG、EGC、C、CAF和EC，第二主成分构成中影响最大的因子为ECG；在第一第二主成分得分值平面中，样品点基本按照品种聚合成群，说明原料品种不同是影响龙井茶的内含成分的主要因素之一；欧氏距离与判别分析结果显示，二级保护区的西湖龙井茶与一级保护区西湖龙井茶之间的差异最大，越州龙井与一级保护区西湖龙井茶产品间差异较小。

龙井茶；相似性；高效液相色谱；线性判别

西湖龙井茶是中国的历史名茶，历史上其产区只包括杭州市西湖周边不到50 km2的区域。从20世纪90年代开始，在杭州及周边地区开始出现了仿西湖龙井茶的扁形茶产品。2001年，浙江省公布了《龙井茶原产地域保护管理办法》，将浙江省内的龙井茶原产地域范围划分为西湖产区、钱塘产区和越州产区三大区块。同时，杭州市颁布的《杭州市西湖龙井茶基地保护条例》又将原西湖区西湖乡内的龙井茶基地规定为西湖龙井茶基地的一级保护区，属西湖区的其余龙井茶基地为二级保护区。2005年7月15日，西湖龙井茶获得了地理标志保护。由于采用的加工工艺十分相似，从外形、滋味、香气等方面很难对不同地区龙井茶进行区分。目前，龙井茶，尤其是西湖龙井茶，受假冒伪劣产品的影响比较严重。因此，需要对不同产地龙井茶的化学组成差异进行分析，并建立龙井茶产地判别的方法。

在茶学研究上，早期的研究基本集中在对茶叶生化成分的定性和定量同时测定[1～4]。此后，开始有了对不同区域来源茶叶的成分组成进行分析辨别的努力[5～6]。相对来说，近红外技术在茶叶成分的定性、定量预测，茶叶产品种类的辨别，茶叶产地的区分方面应用的比较多[7～18]。高效液相色谱（High-performance liquid chromatography，HPLC）是另一个对茶叶进行产区鉴别的分析方法。基于HPCL的化学定量分析，在食品产地鉴别的方面很有发展前景[19]。研究表明，利用HPLC化学成分检测数据，可以对茶叶产区、原料品种等进行鉴别[20～24,5～6]。

本文采集了不同产区的大量龙井茶样本，采用代谢组学的原理，对以儿茶素为主的酚性成分含量进行了液相色谱测定，然后对不同产区龙井茶的组分差异及相似性进行模式识别分析，并尝试用线性判别方法对不同产区产品进行区分。

1 材料和方法

1.1 试验材料和标准品

试验样本为2009年春季收集的不同产区的84个取样点的龙井茶样品，共527个。按照GB/T18650-2008的规定，其中西湖龙井一级保护区茶样（XHLJ1）174份，来自一级保护区内龙井村、梅家坞等10个自然村的27个取样点；西湖龙井二级保护区茶样（XHLJ2）56份，来自二级保护区的10个取样点；钱塘龙井茶样（QTLJ）137份，来自钱塘产区5个县的20个取样点；越州龙井茶样（YZLJ）160份，来自越州龙井产区6个县的27个取样点。为减少样品采摘期对龙井茶产地判别的干扰，从同一采样点，收集采摘前期、中期、晚期的相同原料品种的龙井茶样各1个，其中一个来自春茶开采后约第5天，一个来自开采后约第15天，另一个为第25天。样本的原料品种为无性系品种龙井43（LJ43）和有性群体种（POPN）。

儿茶素（C）、表儿茶素（EC）、表没食子儿茶素（EGC）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、没食子儿茶素没食子酸酯（GCG）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）和咖啡碱（Caffeine, CAF）等标准品购于Sigma公司。

1.2 样品测定

称取3.000 g（粉碎）干茶样，用50%甲醇室温提取15 min后过滤。残渣洗涤3次，合并滤液，定容到100 mL。液相色谱分析采用安捷伦1100 HPLC系统，4 μm Phenomenex RP-MAX C12反相柱，型号规格为250 mm×4.6 mm，柱温40℃；A相为1%甲酸；B相为乙腈；梯度从4%B到25%B，流速1 mL/min，洗脱60 min，检测波长280 nm[25]。

1.3 数据处理

咖啡碱、C、EGC、EC、EGCG、GCG和ECG等组分通过与标准品的比较确认。其他未得到辨认的酚性化合物和生物碱，通过比较保留时间和相对保留时间进行匹配。去除掉一些不够稳定的小峰后，共保留26个HPLC峰用于分析。数理统计、主成分分析和线性判别分析采用 SPSS软件进行；在线性判别分析中，对每类样本采取随机取二留一的方法划分训练集和验证集。

2 结果与分析

2.1 不同产区龙井茶HPLC化学图谱相似度分析

西湖龙井一级保护区（XHLJ1）、西湖龙井二级保护区（XHLJ2）、钱塘产区（QTLJ）和越州产区（YZLJ）4个产区样品的26个面积较大的HPLC共有峰的峰面积平均值和标准差见表1。SPSS的ONE-WAY ANOVA检验表明，在α = 0.05水平下，不同产区龙井茶儿茶素等酚性化合物与生物碱HPLC含量在同一水平，没有显著性差异。

表1 4个产区龙井茶的儿茶素等酚性化合物与生物碱的HPLC平均峰面积

4个产区龙井茶HPLC组份的欧氏距离见表2。从表2可以发现，XHLJ1和XHLJ2之间的欧氏距离最大，QTLJ和YZLJ之间的欧氏距离最小。4个产区龙井茶HPLC组份的欧氏距离和地理距离不一致，XHLJ 1和XHLJ 2之间的地理距离最近的，而欧氏距离却最大。

表2 4个产区龙井茶的HPLC化学组成的欧氏距离

2.2 龙井茶的主成分分析

对龙井茶的HPLC化学组分数据进行主成分分析，共提取出5个主成分（表3），累计贡献率为94.2%，其中前两个主成分的贡献率分别为48%和23%（表3）。从表3可以发现，第一主成分（PC 1）的构成中，对主成分得分值影响较大的因子按系数大小降序为EGCG、EGC、P11、C、CAF和EC，体现了几种主要儿茶素单体成分的影响力；在第二主成分（PC 2）的主要构成中，影响大小依次为ECG、P20、CAF、P3和P16，主要包含的是一些洗脱时间较长的组分。以各样本第一、第二主成分得分值分别作为X坐标和Y坐标作图（图1），发现龙井茶按照品种的不同聚成两个集团，龙井43品种样本（LJ43）主要位于左上方，而群体种样本（POPN）主要位于右下方（图1A），说明原料品种是影响龙井茶内含成分关键性因素之一。但是，按照各样本的第一、第二主成分得分值，未能将不同产地龙井茶分开（图1B）。

表3 主成分的成分矩阵及贡献率

表3续

图1 龙井茶的第一、第二主成分得分值分布

2.3 不同产区龙井茶的线性判别

线性判别分析首先将分析样本分为训练集和验证集两部分，先用训练集样本建立判别模型，然后将训练集中的样本每次轮流抽走一个后重新建模，来判定建立的判别模型的稳定性，最后用验证集样本来验证判别模型的适用性和正确率。对试验数据进行线性判别分析，得到3个判别函数，其函数系数矩阵见表4。判别分析的结果表明（表5），117个西湖龙井一级保护区（XHLJ1）训练集的建模样本中，106个分类正确，10个被划分为越州龙井，1个被误判为钱塘龙井；交叉验证的数据基本一致；而57个验证集样本，49个判定为XHLJ 1，8个判定为YZLJ。在西湖龙井二级保护区（XHLJ 2）的训练集及其交叉验证中，均有三分之一左右的样本被认定成钱塘龙井（QTLJ），验证集中更有近一半的样本被认定成QTLJ。至于QTLJ，无论是训练集还是其交叉验证，或者是外部验证，都有20% ～ 30%的样本被分类成其他几种类别。而YZLJ是判别正确率最高的一类，无论哪种情况，只有少量的样本被判定到XHLJ 1或QTLJ中。

表4 典型判别式函数系数

以各样本的判别函数值作图，在前两个判别函数值FUN 1和FUN 2的投射平面（图2A）上，XHLJ 1位于左上，YZLJ位于左下，而XHLJ 2和QTLJ重叠在右边；在FUN 1和FUN 3组成的投射平面上（图2B）可以看到，XHLJ 1集中于最左边的小块区域内，YZLJ则更靠右一点，而XHLJ 2在右侧集中于上部，而QTLJ较零落地分布在右下部。

图2 4个产区龙井茶的判别分析

表5 判别分析结果

3 讨论

由于不同加工工艺、原料嫩度对茶的品质成分有很大影响，因此不同种类茶的HPLC图谱有较大的差异性,往往比较容易进行区分。而不同产区龙井茶及以龙井茶加工工艺制成的其他扁形茶，因其原料嫩度要求一致、加工工艺相同，其化学组成及 HPLC图谱的相似度很高, 更难对同一茶类进行产区判别。本研究也发现，不同产区龙井茶在儿茶素、咖啡碱等化学成分的含量上没有显著性区别，而且HPLC图谱的相似度高。

进一步的主成分分析结果表明，茶叶中最重要的几类儿茶素单体是构成第一、第二主成分的主要因子。根据前两个组分得分值，相同原料品种的龙井茶样本聚在一起。这一结果进一步验证的就是这样一个事实：由于遗传基础的不同，不同茶树品种所具有的特有的生化成分比例，可以影响成品茶的品质风味。因此，为了得到稳定的产品品质和特色，除加工工艺外，鲜叶原料也应该采用固定的茶树品种或固定的品种搭配比例。这也说明，原料品种会对茶叶产区判别带来较大的干扰。

此外，从不同产区龙井茶的欧氏距离结果可看到，地理距离最近的二级保护区的西湖龙井茶与一级保护区的西湖龙井茶之间的欧氏距离最大；而且在判别分析中，一级保护区与二级保护区的西湖龙井茶之间没有误判。这一结果说明，在被研究的几类茶产品中，二级保护区的西湖龙井茶与一级保护区西湖龙井茶差异最大。相反，地理距离较远的越州龙井与西湖龙井一级保护区间的欧氏距离反而最为接近，两者间的互相误判也相对较多。对这一结果的解释，仅仅考虑地域分布是不够的，可能需要从历史传统和加工技术细节等各方面来加以分析。西湖龙井二级保护区历史上几乎都是生产旗枪茶的，20世纪90年代以后才开始转产龙井茶，直到本世纪初才正式划入西湖龙井产区。旗枪茶与西湖龙井茶外形比较相像，都属于扁形茶，但旗枪更为细长一些，加工工艺上，都有“青锅”和“煇锅”两个工序，但旗枪以前还有“挺锅”工序。这两类茶产品虽然挺类似，但风格特征上仍然存在差异。这些工艺上的风格和习惯，在转产龙井茶并划入龙井产区后，不可避免的还会有一定程度的留存和影响，因此可能是造成这两个产区产品之间存在一定差异的原因之一。而越州产品的龙井茶生产主要来自于上世纪90年代对西湖龙井历史产区的学习和模仿，没有历史工艺的干扰和影响，因此可能在与西湖龙井一级保护区产品的区分上更为困难一些。

本文采用代谢组学原理和模式识别技术研究了龙井茶4个不同产区产品间的相似性和加以鉴别的可行性，虽然这一方法还不能正式用于茶产品产地的鉴别，但是在对于茶学研究中新思维和新技术手段的引进，对于现在越来越多的茶叶地理标志产品认定科学依据的探索，都有良好的推动作用。

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Similarity and Linear Analysis of Longjing Tea from Different Production Areas

WANG Li-yuan1，CHENG Hao1*，HE Wei2，WEI Kang1，ZHANG Cheng-cai1
（1. National Center for Tea Improvement, Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China; 2. College of Horticulture, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China）

In present study, totally 527 Longjing tea samples were collected from four production areas and analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC), combined with principal component analysis(PCA) and linear discriminant analysis(LDA). The result showed that 5 PCs could be extracted and the most important factors in the first PC composition were EGCG, EGC, C, CAF and EC. Meanwhile, the most important factor in the second PC was ECG. And in the score plot of the first two PCs, samples grouped according to the varieties of their fresh leaf material. On the other hand, the result of discriminant and Euclidean distance analysis suggested that the tea samples of Xihu Longjing secondary protection zone had the least similarity to those of primary protection zone. And compared to other two groups, the difference between Yuezhou Longjing and Xihu Longjing primary protection zone was the least.

Longjing tea; similarity; high performance liquid chromatography; linear discriminant analysis

S571.1

A

1001-3776（2014）02-0018-06

2013-08-30；

2014-01-16

浙江省重大科技专项（优先主题）农业项目（2008C12070）

王丽鸳（1978－），女，浙江金华人，副研究员，博士，从事茶树生物工程与遣传育种研究；*通讯作者。