莫西沙星联合头孢哌酮／舒巴坦对耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌防耐药突变浓度的研究

张欣悦，孙成春，公衍文，杨传伟，刘 颖

（1.辽宁医学院研究生院，辽宁锦州121001；2.济南军区总医院药剂科，山东济南 250031；3.济南军区总医院实验诊断科，山东 济南 250031；4.山东明仁福瑞达制药股份有限公司研发部，山东 济南 250104；5.天津药物研究院，天津 300100）

鲍曼不动杆菌为非发酵革兰阴性杆菌，主要引起呼吸道感染、败血症、泌尿系统感染、继发性脑膜炎等。近年来研究表明，鲍曼不动杆菌在医院感染中占第4位，已成为医院感染的重要病原菌，并有逐年升高的趋势［1］。由于碳青霉烯类药物治疗鲍曼不动杆菌感染的疗效较好，在医院感染的治疗中被广泛使用，使得耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌（Carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii，CRAB）越来越多，给临床治疗带来很大困难，已引起临床和微生物学者的严重关注［2］。

Drlica等［3］提出的防突变浓度（mutant prevention concentration，MPC）和突变选择窗（mutant selection window，MSW）理论，为有效抑制细菌耐药及制定应对策略提供了新的思路和参考依据。该理论是指最低抑菌浓度（MIC）到 MPC之间的范围。MPC是防止耐药突变菌株被选择性富集扩增所需的最低抗菌浓度，也是评价抗菌药物防耐药能力的新指标。基于该理论，当两种或以上药物联合应用时，细菌需要同时突变两次或多次才能产生突变菌株，但这种概率非常低，从而使MSW缩小或关闭。目前关于MFX联合CFS对CRAB的MPC的影响研究尚未见报道。本研究通过体外MFX联合CFS对CRAB的MPC影响，探讨抗菌药物联用降低MPC、缩小MSW的规律，为临床合理使用有限的抗菌药物、防止突变菌株的出现提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 抗菌药物与培养基 莫西沙星（0.4 g／片，拜耳医药保健有限公司）；头孢哌酮（cefoperazone，批号：30420-200304，含量：96.5%）、舒巴坦（sulbactam，批号：30430-200305，含量：89.2%）均购自中国药品生物制品检定所。M-H肉汤粉和M-H琼脂平板培养基均购自英国Oxiod公司。

1.2 菌株来源与鉴定 选择我院2010年1月～2012年8月临床标本中分离的20株CRAB。质控菌为铜绿假单胞菌ATCC27853。经VITEK-2分析仪鉴定，采用纸片扩散法（Kirby-Bauer法）进行药敏试验，选取对亚胺培南或美罗培南耐药的鲍曼不动杆菌20株。

1.3 实验仪器 电热恒温培养箱（山东潍坊精鹰医疗器械有限公司）；Vitek比浊仪、VITEK-2全自动微生物分析仪（法国生物梅里埃公司）；XK 96-3型微量振荡器（姜堰市新康医疗器械有限公司）；-80℃超低温冰箱（SANYO Electric Co.Ltd.）。

1.4 最低抑菌浓度的测定

1.4.1 测定单独应用时的MIC 采用微量肉汤稀释法测定MFX和CFS分别使用时的MIC，并按美国临床实验室标准化委员会（CLSI）2012年标准［4］判断结果。

1.4.2 测定MFX和CFS联合应用时的MIC 采用简化棋盘法［5］测定MFX和CFS联用时的MIC。

1.4.3 计算部分抑菌浓度（fractional inhibitory concentration，FIC）指数及判定标准 FIC指数 ＝MIC甲药联用／MIC甲药单用+MIC乙药联用／MIC乙药单用。判定标准：FIC指数≤0.5，协同作用；0.5～1，相加作用；1～2，无关作用；FIC＞2，拮抗作用。

1.5 防耐药突变浓度（MPC）的测定［6-7］

1.5.1 含单药琼脂平板的配制 采用琼脂平板倍比稀释法测定抗菌药物对20株CRAB的 MPC。MFX和CFS的药物浓度范围分别为0.125～512 mg·L-1和2～512 mg·L-1。每个浓度配制4个平板作为平行对照。

1.5.2 含两药琼脂平板的配制 以MFX和CFS的MIC、MPC为基准，采用二倍稀释法配制含MFX与CFS混合的系列不同浓度梯度琼脂平板。最低浓度为MFX和CFS的单药MIC，最高浓度为MFX和CFS的单药MPC，每个浓度4个平板。

1.5.3 菌悬液制备 从新鲜过夜培养的细菌平板上挑取单个菌落接种于20 ml MH肉汤中37℃震荡过夜培养，3 000 r·min-1离心后弃上清，再悬浮在200 ml MH肉汤中，震荡培养6 h，3 000 r·min-1离心，弃上清，调整菌液浓度为3×1013CFU·L-1。

1.5.4 MPC的测定 取100μl 3×1013CFU·L-1菌液均匀涂布于含不同浓度药物的MH平板上，每个浓度4个平板。（35±2）℃培养72 h，以4个平板均无细菌生长的最低药物浓度为MPC。对含单药琼脂平板的测定为单药MPC，对含两药琼脂平板的测定即为联合用药后的MPC。对接近MPC药物浓度筛选出来的菌株接种于无药物的MH平皿，传代两次后，再接种于原筛选药物浓度的平板上，以确定其是耐药突变株。以上实验重复两次，取其平均值。

1.6 统计学分析 采用SPSS 16.0统计软件对相关数据进行配对秩和检验分析。

Tab 1 Accumulative inhibitory rate of MIC（mg·L-1）for 2 antimicrobial agents against 20 strains of CRAB

2 结果

2.1 抗菌药物对20株CRAB的MIC值 MFX和CFS对20株CRAB的MIC范围分别为：0.125～2 mg·L-1、8～32 mg·L-1，见 Tab 1。

2.2 联合药敏 MFX与CFS联用后，协同作用所占的比例为0.45（9／20），相加所占的比例为0.35（7／20），无关作用所占的比例为 0.20（4／20），未见拮抗作用，以协同和相加作用为主。

2.3 抗菌药物单用及联合使用对CRAB的MPC和SI值 MFX、CFS单用对20株CRAB的MPC范围分别为4～64 mg·L-1、128～256 mg·L-1；MFX、CFS联合使用后，两者对20株CRAB的MPC范围分别为：0.5～4 mg·L-1、64～128 mg·L-1。MFX、CFS单用对20株CRAB的选择指数（selectiveity index，SI＝MPC／MIC）分别为：4～128、8～64；MFX、CFS联合使用后两者对20株CRAB的SI分别为：1～8、4～16，见 Tab 2。

3 讨论

鲍曼不动杆菌是一种临床常见和重要的医院感染病原菌。近年来，随着临床治疗中碳青霉烯类抗生素滥用现象的日益普遍，该菌对此类药物的耐药性明显增强［8］，已成为当今医院感染最为棘手的问题之一。

目前临床应用的MIC给药策略，在抑制或杀灭敏感菌的同时，使耐药突变菌得到富集扩增，导致治疗失败。MSW理论［9］表明：当药物浓度高于 MPC时，病原菌必须突变两次或更多次才能生存，而这种突变的概率非常低。豆梅琴等［10］通过测定氟喹诺酮类抗菌药物的MPC，认为当其浓度高于MPC时，可有效防止鲍曼不动杆菌耐药突变体的产生。这与本文MFX单用所测MPC相吻合。结合文献［11］报道的MFX最大血药浓度 Cmax（4.5 mg·L-1），本试验表明：单用MFX，药物浓度往往落在MSW内，易产生耐药。若要增大MFX的给药剂量，可能会给患者带来更严重的风险，可见单用MFX并不能产生理想疗效。

MSW理论表明：当两种不同作用机制的抗菌药物联合应用，并同时处于各自的MIC以上时，细菌很难同时产生两种耐药突变，使其MSW关闭或缩小，从而达到防止耐药菌产生及减少不良反应的目的。Cai等［12］报道了多粘菌素联合左氧氟沙星或妥布霉素可缩小其对多耐药鲍曼不动杆菌的MSW，防止对多粘菌素耐药的菌株出现。本研究的体外联合药敏结果显示，MFX联合CFS主要表现为协同和相加作用，无拮抗作用。因此两药联用，可增强抑菌效果。结合药代动力学参数分析，MFX单用时，其MPC大部分高于Cmax，联合CFS后，MPC明显降低到Cmax以下，有效的限制了耐药菌株的产生；对于CFS，头孢哌酮和舒巴坦的平均血清峰浓度分别为236.8 mg·L-1和130.2 mg·L-1。同 MFX一样，联合使用后，CFS的MPC降到Cmax以下。可见，将临床常用的MFX和CFS联合后，各自MPC明显降低，使其药物浓度高于MPC，进而有效防止耐药菌株的产生；该实验还表明，将MFX与CFS联合使用，SI较其单用均有明显下降。再次证实了联用不同作用机制的抗菌药物可减少耐药菌的产生，获得良好的疗效。

本研究对MFX联合CFS在治疗CRAB感染方面进行了初步探讨，为临床合理使用现有抗菌药物、防止耐药菌产生提供了一定的理论指导和支持。由于体内药物浓度不断变化，影响因素复杂，联合用药时的药代动力学相关参数与耐药突变体富集的关系仍需进行相关的体内研究。

（致谢：本文在统计方面得到了济南军区总医院于莉莉博士的指导和帮助，在此一并感谢！）

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