PTPMeg2抑制NIH3T3／STAT3CA细胞模型STAT3转录活性的研究

苏富琴，王玉春，齐占鹏，孙 超，侯金才

（齐齐哈尔医学院1.药理学教研室、2.肿瘤分子生物学研究室，黑龙江 齐齐哈尔 161006）

肿瘤细胞在受到细胞外刺激时常常通过细胞信号转导通路传递到细胞内。目前，已经有多条细胞信号转导通路得到了深入的研究，如STAT［1］、TGF-β［2］、Wnt［3］信号通路等，这些细胞信号转导通路在肿瘤中起到重要的作用，也常常被用来作为药物的靶点、诊断或判定预后的生物标志物。STAT3（signal transducer and activator of transcription 3）是细胞信号转导和转录激活因子家族的一员。STAT3对于细胞的生长、存活、增殖和分化等生理过程都至关重要［4］。如果STAT3基因处于持续激活状态，就能导致细胞的恶性增殖，从而引发多种肿瘤，如前列腺癌、子宫内膜癌、黑色素瘤和胰腺癌等都可以检测到持续激活的STAT3存在［5-6］。因此，研究STAT3信号通路的负性调控对肿瘤的治疗具有重要的参考价值。

STAT3的异常活化有两种形式，高磷酸化水平的STAT3和持续活化的STAT3。蛋白的表达水平一方面受到蛋白激酶的激活而活化，另一方面受到磷酸酶的调节而抑制活化。PTPMeg2（protein tyrosine phosphotase Meg2，又称PTPN9）是新近发现的一种细胞质酪氨酸磷酸酶。PTPMeg2对磷酸化STAT3的作用有信号通路起抑制作用两种方式，既可以直接对STAT3去磷酸化［7］，还可以通过对EGFR、Her2去磷酸化间接抑制 STAT3活性［8］。我们发现PTPMeg2也可以抑制胰腺癌细胞STAT3的转录活性。本研究通过在无成瘤性的成纤维细胞NIH3T3上建立的持续活化的STAT3细胞模型NIH3T3／STAT3CA，观察PTPMeg2对此模型细胞体内及体外增殖作用的影响，并通过检测STAT3转录活性的变化而探索其作用机制。

1 材料与方法

1.1 质粒和转染试剂 pXJ40／Flag-STAT3及pXJ40／Flag-STAT3CA质粒由曹新民博士（新加坡国立大学）惠赠；pGL3-luc、pGL3／（APRE）4-luc荧光酶报告质粒由Dr.Sachiko Ezoe博士（日本大阪医学院）惠赠；pcDNA3／myc-PTPMeg2及 pcDNA3／PTPMeg2C515S质粒由赵志壮教授（美国Oklahoma健康科学中心）惠赠。Ad／PTPMeg2质粒和 shPTPMeg2质粒由常智杰教授（清华大学）惠赠。转染试剂vigofect购自威格拉斯试剂公司。

1.2 细胞培养及NIH3T3／STAT3CA细胞模型的建立 成纤维细胞NIH3T3于含5%CO2的37℃培养箱中培养，培养基为含10%胎牛血清及1×105U·L-1青霉素、100 mg·L-1链霉素的 DMEM培养基。

将具有新霉素抗性的质粒 pXJ40 vector和pXJ40／Flag-STAT3CA采用 vigofect转染至 NIH3T3细胞中。转染48 h后，收取部分细胞通过Flag标签检测的STAT3CA表达清况。将1／10细胞重新种植于100 mm的培养皿中，加入8×105g·L-1新霉素

（G418）进行生长筛选。间隔1 d更换新霉素，直到细胞增殖得到单克隆，挑取单克隆种植于24孔板中，每孔种植1个克隆。采用维持剂量的新霉素，通过Western blot检测STAT3CA表达挑选出阳性克隆，即为NIH3T3／STAT3CA细胞模型，只转染空载体而建立的稳定细胞系为对照（NIH3T3／vector）。

1.3 细胞转染 取对数生长期细胞，在转染前2.5 h更换新鲜完全培养基。按照vigofect转染说明书，在一个转染管中将需要转入的质粒DNA与100μl 0.9%NaCl混和，在另一转染管中将vigofect与等体积的0.9%NaCl混和，室温放置5 min。然后将含有vigofect的混合液滴加到质粒DNA的混合液中，混匀后再放置15 min后滴入细胞培养基中，摇匀培养基。转染后3 h更换新鲜的完全培养基。

1.4 MTT法对细胞增殖能力的测定 将稳定细胞系 NIH3T3／STAT3CA和对照细胞 NIH3T3／vector，按照800个／孔接种到96孔细胞培养板中，每个处理条件设10个复孔。细胞分别感染Ad／PTPMeg2及腺病毒空载体。每间隔24 h取一个96孔板测定细胞的增殖状态。测定时，弃去培养基，每孔加无血清培养基配制的 MTT 100μl（0.05 g·L-1），继续培养4 h。弃去全部培养基，每孔加入180μl DMSO溶解甲臜颗粒。10 min之内测板，以570 nm为检测波长，以630 nm为参考波长，测定的吸光度值代表细胞的增殖活力，并计算平均值。

1.5 裸鼠异体移植瘤实验 稳定细胞系NIH3T3／STAT3CA，感染腺病毒为载体的 PTPMeg2（Ad／PTPMeg2）和腺病毒空载体（Ad／GFP），感染量采用预实验探索的等量病毒量。24h后收获细胞，PBS洗涤，BalB／c-nu／nu♂裸鼠6只，每只裸鼠按照100μl细胞悬液的容量接种到腋下皮下，左侧腋下接种Ad／GFP感染的 NIH3T3／STAT3CA，右侧腋下接种Ad／PTPMeg2感染的 NIH3T3／STAT3CA。接种细胞数为2×105个每侧。每隔3 d用游标卡尺准确量取肿瘤的直径，短径记作a mm，长径记作b mm。肿瘤体积／mm3＝a×b2／2。裸鼠麻醉，剥离皮下肿瘤，称重，拍照记录。瘤重绘制柱状图，瘤体积绘制折线图。数据通过SPSS统计软件进行成对t检验。

1.6 免疫共沉淀实验（Co-IP）及 Western blot HEK293T细胞分别单独转染 pcDNA3／Myc-PTPMeg2、pXJ40／Flag-STAT3CA，共同转染 pcDNA3／Myc-PTPMeg2分 别 与 pXJ40／Flag-STAT3CA 及pXJ40／Flag-STAT3。收获转染24 h的细胞，用细胞裂解液 （80 mmol· L-1KCl，10 mmol· L-1Na2HPO4，1 mmol·L-1EDTA（pH＝8.0），0.5%NP-40，10%Glycerol.1 mmol·L-1DTT，1 mmol·L-1PMSF，1 mg·L-1Aprotinin，2 mg·L-1Leupeptin，2 mg·L-1Pepstatin，0.1 mmol·L-1Na3VO4）裂解细胞。冰上放置30 min，4℃12 000 r·min-1×15 min离心。取细胞裂解物加等容的2×SDSPAGE上样液煮10 min，-20℃保存备用。其余的细胞裂解物，加入2μg Flag抗体，4℃混合4 h。然后在上述混合物中加入30μl G蛋白偶联的葡聚糖颗粒悬浮液，4℃旋转混合过夜。洗涤葡聚糖颗粒4次，在沉淀中加入30μl 2×SDS-PAGE上样液煮10 min。Western blot杂交分析蛋白表达。使用10%的SDS-PAGE胶电泳，转膜后用Western blot检测相应的结合蛋白。

1.7 荧光素酶报告实验 24孔板细胞的对数生长期细胞，细胞融合度达到60%～70%时进行转染。DNA转染总量为300 ng／孔，其中荧光酶报告质粒pGL3／（APRE）4的转染量为 100 ng；内参质粒pRLTK的转染量为5 ng；PTPMeg2WT质粒的转染量为50 ng，PTPMeg2C515S质粒的转染量为200 ng，空载体组转染pcDNA3.1质粒。最后用空载体质粒补足以使每孔转染的DNA总量相同。每组设3个重复。转染24 h后用PBS洗涤，裂解液充分裂解细胞。依次加入30μl荧光素酶催化底物I和20μl细胞裂解物，Top count测定萤火虫荧光素酶活性值。再在相同孔中加入30μl内参催化底物Ⅱ，再次测定海肾荧光素酶的活性值。以海肾荧光素酶的活性值为内参，计算报告基因的相对转录活性，也就是萤火虫荧光素酶活性值与海肾荧光素酶活性值的比值。用±s记录结果，并进行统计学分析。

1.8 统计学分析 使用SPSS 13.0统计分析软件，计量资料采用One-way ANOVA方法进行组间方差分析，成对t检验结果采用双测检验标准。

2 结果

2.1 PTPMeg2抑制 NIH3T3／STAT3CA细胞的体外增殖 MTT实验结果显示，NIH3T3／STAT3CA细胞的增殖速度比NIH3T3／vector细胞明显加快（P＜0.01，Fig 1），这与活化的STAT3促进细胞增殖的结果相一致。在PTPMeg2存在时，NIH3T3／STAT3CA细胞的增殖速度明显减慢（P＜0.01），说明 PTPMeg2对STAT3CA的细胞促增殖具有负性调控作用。

2.2 PTPMeg2抑制 NIH3T3／STAT3CA细胞的体内增殖 既然PTPMeg2对NIH3T3／STAT3CA细胞具有体外的增殖抑制作用，那么体内是否也存在这种一致的抑制作用？我们采用了裸鼠异体移植瘤，以腺病毒为载体表达PTPMeg2，观察PTPMeg2的作用。结果NIH3T3／STAT3CA高表达PTPMeg2后，肿瘤明显较对照组小（Fig 2，A和 B），肿瘤重量（1.643±0.404）g较对照组（0.367±0.203）g有明显的减低（P＜0.01，Fig 2，C）。进一步证明了PTPMeg2对STAT3CA的促增殖具有抑制作用。

2.3 PTPMeg2与STAT3CA存在相互作用 PTPMeg2对STAT3CA的负性调控是否直接作用引起的？为了回答这个问题，我们采用了免疫共沉淀实验，结果显示在PTPMeg2与Flag-STAT3CA的复合物中可见明显的相互作用条带（Fig 3，第3列），并且强于与STAT3的相互作用（Fig 3，第4列）。说明PTPMeg2与STAT3CA存在相互作用，这种相互作用是其功能的基础。

2.4 PTPMeg2对STAT3的转录活性具有抑制作用 为了进一步探索PTPMeg2对STAT3CA的负性调控机制，STAT3信号通路最终是在细胞核内激活了相应的转录基因，而引起相应的功能效应。我们采用了 STAT3的报告基因质粒 pGL3／（APRE）4，双荧光素酶实验的结果显示，PTPMeg2对STAT3CA的STAT3的转录活性有明显的抑制作用，并且呈现剂量依赖关系（结果未显示），而PTPMeg2的功能缺失突变体PTPMeg2C515S则失去了转录抑制作用（Fig 4，上图）。我们又进一步采用了PTPMeg2的发夹干扰 RNA，从另一个方面也证明了 PTPMeg2对STAT3CA的STAT3的转录活性有明显的抑制作用（Fig 4，下图）。

Fig 1 PTPMeg2 inhibits NIH3T3／STAT3CA cell proliferation in vitro**P＜0.01，STAT3CA／GFP group vs Vector／GFP group；#P＜0.05，##P＜0.01 STAT3CA／PTPMeg2 vs STAT3CA／GFP group.

Fig 2 PTPMeg2 inhibits NIH3T3／STAT3CA cell proliferation in vivoTumor formation was observed（A）in nude mice injected with 2×105 NIH3T3／STAT3CA cells infected with CA／GFP（left）or CA／PTPMeg2（right）.Xenograft tumors（B），tumor volumes（C）and tumor weights（D）are shown.**P＜0.01 vs CA／GFP group

3 讨论

经典的JAK-STAT信号转导通路的传递过程如下：来自细胞外的化学刺激信号，如干扰素、白介素6（IL-6）、生长因子与细胞膜上相应的受体结合，这就激活了JAK激酶的活性，JAK激酶进行自身磷酸化，接下来STAT3蛋白结合到被磷酸化的受体上，被JAK激酶磷酸化并二聚化，磷酸化的STAT3蛋白从细胞质中进入细胞核中，结合到DNA上，启动相应STAT3的基因转录，从而调节细胞增殖、分化和生存。此外，受体酪氨酸激酶类（EGFR）不通过JAK激酶的磷酸化，可以直接使STAT3的酪氨酸磷酸化。第3种途径是非受体酪氨酸激酶途径，即c-Src激酶等可以使STAT3磷酸化。由此可见，STAT3信号转导途径的核心点就是STAT3的激活。STAT3的持续激活是肿瘤发生和进展的一个关键因素，表现为磷酸化和持续活化两种形式。因此，医药工作者采用多种手段去抑制活化的STAT3作为治疗肿瘤的策略。

Fig 3 PTPMeg2 interacts with STAT3CA in HEK239T cellsHEK293T cells were transfected Flag-STAT3CA plasmid only in lane 1，Myc-PTPMeg2 plasmid only in lane 2，co-transfected Flag-STAT3CA and Myc-PTPMeg2 plasmid in lane 3，co-transfected Flag-STAT3 and Myc-PTPMeg2 plasmid in lane4.The antibodies precipitated and blotted are shown.

Fig 4 PTPMeg2 inhibits STAT3 transcriptional activity in STAT3CA cell modelUp：PTPMeg2 and its mutant PTPMeg2C515S affected the STAT3 transcriptional activity.Down：PTPMeg2 and ShPTPMeg2 had an effect on STAT3 transcriptional activity.**P＜0.01 vs vector group；#P＜0.05 vs mock group.

抑制活化的STAT3有两种方式：间接途径和直接途径。间接途径如在信号通路上游干扰配体与受体的结合，如应用抗IL-6和IL-6受体的单抗阻断配受体结合可以抑制神经胶质瘤的生长［9］。其次，可以酪氨酸激酶的抑制剂（AG490［10］、Lamatinib［11］）抑制受体和（或）STAT3蛋白上酪氨酸或丝氨酶残基的磷酸化，可完全阻止STAT3信号进一步下传。还可以通过酪氨酸磷酸受体-激酶复合物［包括细胞因子信号抑制因子（SOCS）、活化的STAT3蛋白抑制因子（PIAS）［12］］形成。直接途径即直接阻断活化的STAT3的水平和功能治疗肿瘤。比如采用小分子物质直接抑制STAT3与DNA结合，合成寡核苷酸诱捕STAT3。直接使用磷酸酶，使磷酸化的STAT3去磷酸化也是一种直接策略。我们以前的工作发现磷酸酶PTPMeg2可通过去磷酸化STAT3而达到抗乳腺癌的作用［7］。本研究与前期工作的区别在于探索了STAT3磷酸化以外的另一种活化形式——持续活化的 STAT3（STAT3CA），并观察了PTPMeg2对STAT3CA细胞增殖及转录活性的影响。

药理学研究中常常利用疾病的发病机制而构建疾病模型，用于筛选药物或者研究药物的作用机制。STAT3CA（constitutively activated STAT3）［13］分子的建立最早就是用于证明STAT3是一种原癌蛋白。STAT3CA分子的构建是在STAT3 C末端SH2结构域A661和N633的位置上插入了2个半胱氨酸，这样半胱氨酸就可以自动形成二聚体，而不是依赖Y705的磷酸化位点形成二聚体。二聚体结合DNA，激活相应的转录基因。STATCA自身可以介导细胞的转化，因此可以作为肿瘤STAT3持续激活的模型。本研究利用肿瘤中存在持续活化的STAT3，在正常的人成纤维细胞上构建了持续激活的NIH3T3／STAT3CA细胞模型，该模型细胞改变了亲本细胞NIH3T3不能够成瘤的特性，具有快速增殖能力和在裸鼠体内成瘤的能力。Rong等［14］利用该细胞模型研究了WT1对STAT3的激活作用，探索了WT1在肾脏肿瘤中的促癌作用。本研究利用该细胞模型探索磷酸酶PTPMeg2对持续激活STAT3的抑制作用。结果发现，PTPMeg2对NIH3T3／STAT3CA细胞的体内和体外增殖能力均有抑制作用。PTPMeg2与STAT3CA存在相互作用，并发现PTPMeg2对STAT3CA的转录活性有明显的抑制作用。通常情况下，PTPMeg2是磷酸酶，对磷酸化的STAT3起到直接的去磷酸化作用［7］，或者通过抑制磷酸化EGFR而间接降低磷酸化STAT3的水平［8］。而PTPMeg2对STAT3CA的影响也显示明显抑制作用，而实际上 STAT3CA细胞中的磷酸化STAT3的水平并不高，PTPMeg2对STAT3CA抑制的详细机制并不清楚，需要进一步探索。

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