抑制Bmi-1基因表达对鼻咽癌细胞生物学行为的影响

李海玉，陈兴凤，余思颖，刘革力，宋方洲

（重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心，生物化学与分子生物学教研室，重庆 400016）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是中国南方省份及东南亚地区比较常见的恶性肿瘤，尤其是我国广东、广西，具有明显的种族聚集性和地域性。研究表明NPC的发生发展是多因素作用的结果，其中许多重要基因参与其发生发展的过程，已报道MMP9、VIM等基因的异常表达促进了鼻咽癌的发生。因此，研究和鼻咽癌发生相关的基因，将有助于进一步揭示鼻咽癌的发病机制及预后。

Bmi-1（B-cell-specific moloney murine leukemiavirus insertion site 1，Bmi-1）基因是1991年在鼠淋巴细胞发现的多梳基因（polycomb group genes，PcG）家族的重要成员之一［1］。Bmi-1广泛表达于多种肿瘤中并与肿瘤的发生发展密切相关，例如乳腺癌［2］、前列腺癌［3］、胰腺癌［4］等。有学者发现鼻咽癌中Bmi-1的mRNA及蛋白水平表达均较高，表明Bmi-1与鼻咽癌进展及转移有关［5］。为了进一步研究Bmi-1与鼻咽癌侵袭迁移的关系，采用小干扰RNA技术沉默鼻咽癌细胞株CNE-1中Bmi-1的表达，观察沉默Bmi-1表达后，CNE-1细胞生物学行为变化，为探讨Bmi-1在鼻咽癌侵袭迁移中的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 RPMI 1640培养基、胎牛血清购自Hyclon公司。RT-PCR试剂盒、qRT-PCR试剂盒购自TaKaRa公司。Total RNA提取试剂盒购自OMEGA公司。Opti-MEM、Lipofectamine RNAiMAX购自Invitrogen公司。Negative control siRNA、BMI-siRNA-269由上海吉玛基因公司合成。Bmi-1、β-actin的引物由上海生工生物公司合成。小鼠抗人的Bmi-1单克隆抗体购自Upstate公司，小鼠抗人β-actin单克隆抗体、HRP标记的羊抗鼠IgG购自Santa Cruz公司。Matrigel胶购自Bio-Rad公司，Transwell小室购自Millipore公司。

1.2 细胞培养 CNE-1细胞由重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心保存。采用含10%胎牛血清、1×105U·L-1青霉素和100 mg·L-1链霉素的RPMI 1640培养基，置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。0.25% 胰酶消化细胞，2～3 d传代1次，取对数生长期细胞实验。

2 方法

2.1 siRNA的合成及转染 由本课题组前期筛选出的有干扰效果的BMI-siRNA-269，正义链：5′-AUGAAGAGAAGGGAUUTT-3′，反义链：5′-AAUCCCUUCUCUUCAUTT-3′。阴性对照 GFP-Si正义链：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反义链：5′-ACGUG

ACACGUUCGGAGAATT-3′。干粉 siRNA用 DEPC水稀释成20μmol·L-1，-20℃保存。转染前24h，取对数生长期的细胞0.25%胰酶消化，计数后每孔按2×105个细胞接种于6孔板中，待细胞融合度达到60%～70%，按Lipofectamine RNAiMAX说明书进行操作。细胞分3组：（1）空白组（只加 Lipofectamine RNAiMAX Reagent）；（2）对照组（GFP-siRNA／Lipofectamine RNAiMAX复合物）；（3）实验组（BMI-siRNA269／RNAiMAX复合物）

2.2 实时荧光定量PCR检测mRNA表达水平将转染48 h后的空白组、GFP-Si组、Bmi-1siRNA-269组细胞提取Total RNA，核酸浓度测定仪测定其浓度和纯度，按TaKaRa逆转录反应说明书合成cDNA。用于扩增Bmi-1cDNA的上游引物为：5′-GACCACTACTGAATATAAGG-3′，下 游 引 物 为：5′-CATTTGTCAGTCCATCTCTC-3′；β-actin的上游引物为：5-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′，下游引物 5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′。cDNA产物 10倍稀释后以β-actin为内参进行实时荧光定量PCR，反应条件为95℃预变性5 min；95℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃300 s（39个循环）；反应结束建立溶解曲线。同一实验重复3次，实验数据分析采用2-▲▲ct法计算。

2.3 Western blot检测蛋白的表达水平 siRNA转染72 h后分别收集各组细胞，按碧云天公司蛋白提取说明书进行，采用BCA法测定蛋白浓度。取40 μg／孔蛋白样品上样，经12%SDS-PAGE后，将目的蛋白转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，与一抗（Bmi-1、β-actin）4℃摇床孵育过夜，TBST洗3次，每次10 min，再分别与相应HRP标记的二抗室温孵育2 h，ECL化学发光。

2.4 Matrigel检测CNE-1细胞侵袭能力 将Matrigel胶置于4℃过夜，用无血清预冷的RPMI 1640培养基按8∶1稀释Matrigel胶混匀，每孔60μl均匀铺在24孔Transwell上室的聚碳酸酯膜上，37℃孵箱1 h。收集转染24 h后的各组细胞，计数后按2×103个细胞／孔接种于上室。将小室放于24孔板中，上室加入200μl无血清RPMI 1640培养基，下室加800μl含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，37℃、5%CO2培养24 h后取出小室，用棉签擦掉上室细胞，PBS洗3次，800μl甲醇固定30 min，结晶紫染色15 min，PBS冲洗干净，室温风干。显微镜下取5个视野计数，取其平均值，每组重复3次。

2.5 Transwell检测CNE-1细胞迁移能力 Tranwell实验不铺 Matrigel胶，37℃、5%CO2培养12 h取出小室，其余步骤参照侵袭实验。

2.6 流式细胞术检测细胞的周期 siRNA转染48 h后胰酶消化收集各组细胞，1 000 r·min-1离心5 min，弃去上清液，PBS洗涤两次，最后加入1 ml PBS重悬并转移至1.5 ml的EP管中。加入5μl Annexin-FITC轻摇震荡混匀，4℃孵育15 min，然后再加入5μl的碘化丙啶4℃孵育15 min，在流式细胞仪上进行细胞凋亡的检测。每组实验分别独立重复3次。

2.7 流式细胞术检测细胞凋亡 siRNA转染48 h后胰酶消化收集各组细胞，1 000 r·min-1离心5 min，弃去上清液，PBS洗涤两次，之后加入250μl PBS缓慢吹匀细胞，再加入750μl预冷无水乙醇，4℃固定过夜。离心后弃上清液，PBS洗涤1次，每个样本中加500μl 1×FACS buffer和2.5μl RNaseA混匀室温孵育15 min，再加入25μl PI，室温避光孵育15 min，转移至流式检测管中，放在流式细胞仪上进行DNA含量分析。每组实验分别独立重复3次。

2.8 CCK-8测定细胞的生长增殖曲线 分别取对数生长期空白组、对照组和实验组的细胞，血球计数板计数，以每孔5 000个细胞接种于96孔板中，每组3个复孔。在细胞贴壁后0、24、48、72、96 h检测细胞生长情况，每孔加入10μl CCK-8试剂，37℃孵育2 h，在酶标仪上450 nm测OD值。

2.9 统计学分析 采用SPSS 17.0统计学软件，计量资料用x¯±s表示，两组均数比较两组均数比较采用t检验，多组均数比较采用单因素方差分析。

3 结果

3.1 Bmi-1 siRNA在CNE-1细胞中干扰效率的检测 与空白组、对照组相比，实验组Bmi-1基因mRNA和蛋白表达水平明显下降（P＜0.05），空白组和阴性对照组无明显差别（Fig 1，2）。说明Bmi-1基因被有效沉默。

Fig 1 Bmi-1 mRNA expression detected by real-time fluorescence quantitative PCR

Fig 2 Bmi-1 protein expression detected by Western blot

3.2 抑制Bmi-1基因表达，CNE-1迁移能力的变化 siRNA转染48 h后，显微镜下计数空白组、对照组和实验组穿过Transwell上室的细胞数，并进行统计分析，结果显示，与空白组、对照组相比，实验组穿过小室的细胞数明显减少（P＜0.05），而空白组、对照组无明显差异（P＞0.05）。说明Bmi-1基因被沉默后，CNE-1细胞的迁移能力明显下降（Fig 3）。

3.3 抑制Bmi-1基因表达，CNE-1侵袭能力的变化 显微镜下计数空白组、对照组和实验组穿过基底膜的细胞数，并进行统计分析，结果显示，与空白组、对照组相比，实验组穿过基底膜的细胞数明显减少（P＜0.05），而空白组和阴性对照组的细胞数无明显差异（P＞0.05）。说明Bmi-1基因被沉默后，CNE-1侵袭能力下降（Fig 4）。

Fig 3 Transwell migration assay of CNE-1 infected with siRNAA：Blank group；B：Control group；C：Experimental group（×100）

Fig 4 Matrigel invasion assay of CNE-1 infected with siRNAA：Blank group；B：Control group；C：Experimental group（×100）

3.4 抑制Bmi-1基因表达后，CNE-1细胞周期的变化 流式细胞术检测细胞周期结果显示：空白组和对照组的G1期细胞所占比例分别为54.61%和58.03%，S期细胞所占比例分别为35.29%和33.92%，空白组和对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。实验组G1期及S期细胞所占比例分别为73.71%和19.00%，与空白组、对照组比较，实验组G1期细胞明显增多，S期细胞减少，统计分析具有明显差异 （P＜0.05），见Fig 5。

3.5 抑制Bmi-1基因表达后，CNE-1细胞凋亡的变化 流式细胞术检测凋亡结果显示：空白组、对照组和实验组的凋亡率分别为 1.48%、1.17%、1.31%。实验组与空白组、对照组比较差异无显著性（P＞0.05），见 Fig 6。

3.6 CCK-8检测细胞的生长 通过对细胞贴壁后0、24、48、72、96 h检测，发现 Bmi-1基因被沉默后，CNE-1细胞的生长明显受到抑制（Fig 7）。

Fig 5 Cell cycle distribution of CNE-1 infected with siRNAA：Blank group；B：Control group；C：Experimental group

Fig 6 Cell apoptosis of MDA-MB-231 infected with siRNA measured by flow cytometryA：Blank group；B：Control group；C：Experimental group

Fig 7 Cell growth curve measured by CCK-8

4 讨论

Bmi-1基因是多梳基因家族的成员，参与细胞的增殖调控，对造血干细胞自我更新及分化潜能起着至关重要的作用［6-7］。已有研究证实，Bmi-1的表达水平与多种肿瘤的恶性程度和转移能力有关。那么，Bmi-1是否与鼻咽癌的侵袭转移等恶性生物学行为相关呢？为探讨这个问题，本实验采用了前期课题组筛选出的针对Bmi-1基因有干扰效果的siRNA，研究Bmi-1被沉默后，鼻咽癌细胞株CNE-1生物学行为的变化。采用基质胶模型来研究肿瘤细胞侵袭迁移，它可以在体外模拟肿瘤细胞降解细胞外基质和穿过基底膜的侵袭迁移过程。敲除Bmi-1基因后，CNE-1细胞侵袭、迁移能力明显下降，细胞被阻滞在S期，说明Bmi-1与鼻咽癌的恶性发展过程有密切关系。

Bmi-1在肿瘤的发展中起重要作用，它可负向调节ink4a位点，下调p16Ink4a和p19Arfde的表达，从而抑制c-myc基因诱导凋亡的作用，导致肿瘤的发生［8-10］。Bmi-1过表达可引起上皮间质转化（epithelial to mesenchymal transtion，EMT），EMT促进鼻咽癌细胞的浸润和转移，并靶向作用于肿瘤抑制子PTEN，激活 PI3k／AKT／Snail途径，抑制 E-cadherin生成，促进鼻咽癌的发生发展［11-12］。

Bmi-1可能通过不同的途径在转录或翻译水平调控与鼻咽癌侵袭转移相关基因的表达。一方面，Bmi-1作为细胞癌基因，被激活后高表达于鼻咽癌细胞中，参与调控细胞的分裂。高表达Bmi-1的细胞通过抑制p16INK4a表达，延长细胞的增殖周期，阻止细胞凋亡［13］。在转基因鼠中，Bmi-1表达抑制导致其神经功能上的缺失，还引起淋巴细胞的细胞周期严重停滞，而过表达Bmi-1的转基因鼠则引发了鼠的淋巴瘤［14］。因此，有可能因为 Bmi-1下调p16INK4a的表达而导致乳腺癌细胞周期延长，增殖旺盛。另一方面，Bmi-1也可能在蛋白水平直接与肿瘤浸润转移相关因子发生作用，但有关这方面的文献极少，有待进一步研究。今后的实验重点就是找出Bmi-1作用的下游靶基因，探明Bmi-1促进鼻咽癌侵袭转移的分子机制。总之，本研究说明Bmi-1在鼻咽癌的恶性发展中有重要作用。Bmi-1被沉默后，可以明显抑制鼻咽癌细胞株CNE-1的侵袭、迁移能力。但是，Bmi-1基因在鼻咽癌发生发展中的作用机制，以及在侵袭迁移中的分子机制和信号通路尚需进一步的研究。我们相信本研究将为临床治疗鼻咽癌提供新的策略。

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