miR-146a基因多态性与腔隙性脑梗死的关系

(广东医学院附属医院，广东湛江524001)

腔隙性脑梗死(LI)是脑卒中最常见的一种类型，尽管病变面积不大，也会造成严重功能障碍，如血管性痴呆等［1］。微小RNA(miRNA)参与调节动脉粥样硬化(AS)的形成，而AS是常见脑血管病的共同病理基础［2，3］。研究证明，miR-146a 在人 AS 斑块中显著上调［3］，其多态性已被证实与多种疾病的发生相关［5～7］，但与LI的相关性尚未见报道。2011年2月 ～2012年 9月，我们探讨了 miR-146a rs2910164和rs57095329位点的基因多态性与LI的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 纳入患者均符合全国第四届脑血管病会议修订的LI诊断标准，并经头颅CT/MRI证实，梗死灶直径＜15mm;排除房颤、血液病、结核、恶性肿瘤、大动脉炎、周围血管疾病或周围血管栓塞性疾病及严重肝肾功能不全者。选择广东医学院附属医院就诊并符合上述标准的患者173例(观察组)，与观察组性别、年龄匹配的非心脑血管疾病门诊体检者298例(对照组)。观察组男118例、女55例，年龄(69.89±9.78)岁;对照组男 192 例、女 106 例，年龄(69.58±8.72)岁。

1.2 方法

1.2.1 miR-146a基因型检测 采用SNaPshot法。采集空腹静脉血0.5 mL，按试剂盒说明书提取基因组DNA。选择miR-146a的多态位点rs2910164和rs57095329［5，7］，采用 Primer3.0 软件设计合成引物，rs2910164上游引物:5'-AACTGAATTCCATGGGTTG-3'，下游引物:5'-CACGATGACAGAGATATCCC-3'，扩增长度:232 bp;rs57095329上游引物:5'-TCATTGGGCAGCCGATAAAG-3'，下游引物:5'-AGGAAGTTCTGGTCAGGCG-3'，扩增长度:318 bp。PCR 反应体系为 20 μL:10 ×HotStarTaq buffer 2.0 μL，3.0 mm Mg2+4.0 μL，上、下游引物各20 pmol，0.3 mm dNTP 0.5 mmol，1 U HotStarTaq DNA Polymerase 1.0 U，样本 DNA 0.2～0.5 μg及灭菌去离子水适量。扩增条件:95℃ 2 min;94℃ 20 s，65℃ 40 s，72 ℃ 90 s，共11个循环;94 ℃ 20 s，59 ℃ 30 s，72℃ 90 s，共24个循环;72℃ 2 min，4℃保存。PCR产物经纯化后，上样于ABI3130XL测序仪中，使用GeneMapperV4.1软件对结果进行分析。

1.2.2 颈动脉内膜中层厚度(CIMT)检测 采用B型彩色多普勒超声仪，探头频率为10 MHz。分别测量患者两侧颈总动脉前后壁的CIMT，取其平均值。

1.2.3 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，率的比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组miR-146a基因多态性比较 两组miR-146a rs2910164和rs57095329位点的基因型分布经χ2检验均符合Hardy-Weinberg平衡，表明该基因型分布在所研究的人群中已达到了遗传平衡，可以进行候选基因的关联分析。两组miR-146a基因多态性比较，见表1。

2.2 两组不同性别、年龄miR-146a基因多态性比较 见表2。

表1 两组m iR-146a基因的基因型和等位基因频率比较［例(%)］

表2 两组不同性别、年龄m iR-146a基因型和等位基因频率比较［例(%)］

2.3 观察组miR-146a正常和突变基因型患者的CIMT比较 观察组miR-146a rs2910164位点CC、CG+GG基因型患者的 CIMT分别为(0.128±0.028)、(0.137±0.051)cm，miR-146a rs57095329 位点 AA、AG+GG基因型患者的 CIMT分别为(0.134±0.046)、(0.131 ±0.035)cm，P 均 ＞0.05。

3 讨论

近年来LI发病率持续升高，颅内穿支AS被认为是LI的重要病因［8］。据推测，人类基因组上约有1/3的基因受到miRNA的调控，其调节紊乱可导致多种病理过程［9］。miR-146a通过TLR介导的信号通路参与细胞的天然免疫，调节炎症应答、肿瘤发展及抗病毒免疫［8，10］;靶向 CD40L来调节炎症性细胞因子的分泌和成熟过程［11］;靶向TLR4抑制ox-LDL诱导的脂质积累和炎症应答［12］。miR-146a在人AS斑块中显著上调［3］，并能促进 Th1细胞的分化［13，14］。miR-146a 前体中 rs2910164 的多态性已被证实与肝癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、甲状腺癌、胃癌等疾病相关［5～7，10］，而 rs57095329 位点也被证实能影响miR-146a的成熟，与系统性红斑狼疮的易感性相关［7］。

本研究中发现，携带rs2910164位点GG基因型或G等位基因的人群，其患LI的风险显著降低，原因可能是rs2910164位点的C/G变异影响了前体miR-146a的成熟和 miR-146a的表达，使得 miR-146a在AS中的作用被削弱。本研究还发现，两组不同性别者miR-146a rs2910164和rs57095329位点的基因型和等位基因频率无显著差异，而携带miR-146a rs2910164位点G等位基因70岁以下者患LI的风险显著降低。最近一项韩国的研究认为，miR-146a rs2910164位点的G等位基因在缺血性脑卒中起致病作用［15］;而 Liu 等［16］在中国汉族人群中的研究认为，miR-146a rs2910164多态与缺血性脑卒中的发病无关。以上均与本研究中 miR-146a rs2910164的G等位基因可能是LI保护性因素的观点相悖，可能与种族差异、入组标准、试验方法及其他环境因素等对结果的影响有关。

CIMT是AS早期表现形式的一种，大量研究证实，CIMT升高与AS进展及脑梗死的发病相关。因此，CIMT被认为是脑梗死的强效预测因子。本研究结果显示，miR-146a rs2910164和rs57095329的基因突变对LI患者CIMT的影响无显著性差异，这可能与miR-146a基因在AS早期对CIMT的影响不明显有关。

综上所述，LI患者miR-146a基因rs2910164位点G等位基因频率降低，G等位基因可能是其发病的一种保护性因素。未来的研究中，我们仍需扩大样本进行检测，进一步对miR-146a基因多态性对LI发病的影响及作用机制进行探讨。

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