直结肠癌缺失基因在肾透明细胞癌组织中的表达变化及意义

于广洋，孙 岩，齐 灿，顾兴洲，杨小清，韩瑞发

(1天津医科大学第二医院，天津300211;2天津市泌尿外科研究所;3天津市泌尿外科基础医学重点实验室)

肾细胞癌(RCC)是起源于肾实质泌尿小管上皮系统的恶性肿瘤，占成人恶性肿瘤的2% ～3%［1，2］。肾透明细胞癌(ccRCC)是 RCC 最常见类型，占全部 RCC的 80%［2］。直结肠癌缺失基因(DCC)由Sato等［3］首先确定并命名，是当前发现的最长的人类抑癌基因。近年来发现，DCC不仅在结肠肿瘤中表达缺陷，在胰腺、卵巢、子宫、乳腺、血液系统等多种肿瘤中表达减少或缺失，且与这些肿瘤的发生、发展密切相关［4～9］。本研究观察 DCC在ccRCC组织中的表达，并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 天津医科大学第二医院2006年6月～2008年6月具有完整临床及随访资料的ccRCC患者术后常规石蜡包埋标本132例，均进行Fuhrman分级及2009年AJCC的TNM分期，均由2名病理科医师确诊，术前、术后均未接受放疗、化疗、免疫治疗或靶向治疗。同时取距离病灶2 cm以上的癌旁组织作为对照。

1.2 方法

1.2.1 DCC检测 采用免疫组化SP法。步骤严格按说明书进行。每例连续切片5张，厚5μm;切片经二甲苯脱蜡及梯度乙醇逐步水化后，0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH=6.0)进行微波抗原修复20 min;3%H2O2灭活内源性过氧化物酶，避光静置20 min;滴加DCC一抗，4℃孵育过夜;取出后37℃复温30 min;滴加 HRP标记聚合物，37℃孵育20 min;DAB显色，苏木素复染细胞核。以PBS缓冲液为一抗作为阴性对照。DCC抗体为鼠抗人单克隆抗体，购于英国Abcam公司。

1.2.2 免疫组化染色结果判定 DCC蛋白主要定位于细胞膜、细胞质，以细胞膜、细胞质出现黄色、棕黄色或棕褐色均质染色为阳性，细胞不染色或与间质背景一致为阴性。随机选择5个视野(×400)，根据着色细胞数的比例判定反应强度:阳性细胞＜10%为－，10% ～60%为+，＞60%为++，+、++均记作阳性［10］。

1.2.3 随访方法 采用电话及书信方式对患者进行随访，总体生存时间定义为术后至死亡或随访终点的时间。随访截止日期为2013年6月。

1.2.4 统计学方法 采用 SPSS17.0统计软件。DCC在ccRCC与癌旁正常肾组织间表达差异，及其与临床病理因素的关联性检测，采用χ2或Fisher精确性检验方法。采用Kaplan－Meier法绘制DCC阳性与阴性ccRCC患者的生存曲线，采用Log－rank检验比较DCC阳性与阴性ccRCC患者总生存率。采用COX回归进行单因素及多因素分析，判断影响ccRCC患者预后的独立影响因素。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DCC表达情况 DCC在ccRCC组织和癌旁正常组织中的阳性表达率分别为39.39%(52/132)、100%(132/132)，P ＜0.05。见插页Ⅲ图7。

图7 ccRCC组织及癌旁正常组织中DCC免疫组化染色图片（×400）

2.2 DCC表达与ccRCC临床病理参数的关系DCC表达与ccRCC组织中TNM分期、病理分级、区域淋巴结转移、远处转移及大血管浸润相关(P均＜0.05);与年龄、性别、肿瘤大小无关(P 均 ＞0.05)。见表1。

表1 ccRCC组织中DCC表达与临床病理参数间的关系

2.3 生存分析结果 随访时间12～84个月，中位时间60个月。随访期间，44例(33.33%)死亡。Log－rank显示DCC阳性及阴性ccRCC患者的总生存率差异具有统计学意义(P=0.011)。见图1。

2.4 单因素及多因素分析结果 DCC表达情况、TNM分期、病理分级、区域淋巴结转移、远处转移及大血管浸润是ccRCC预后的独立影响因子，P均＜0.05。见表2。

3 讨论

图1 DCC阳性及阴性ccRCC患者的生存曲线

表2 ccRCC影响因子的COX单因素及多因素分析

DCC定位于18q21.3，有29个外显子、28个内含子，现已明确DCC基因含转录起始部位、信号肽基因及编码跨膜蛋白的基因位点。DCC蛋白为跨膜蛋白，主要由细胞质内(325个氨基酸)和细胞质外(1100个氨基酸)两部分组成，细胞膜外多肽的氨基酸顺序和神经细胞黏附分子(NCAM)及相关的细胞表面糖蛋白相似，具有同源性［11］。NCAM可以通过介导细胞之间、细胞与基质之间的相互作用，影响细胞生长、分化、信号传递等［12］。Chan 等［13］报道，DCC蛋白具有与神经生长因子1(Netrin－1)直接结合的活性，并能发挥受体作用，提示DCC蛋白是Nertin－1受体。Netrin受体处于开放(on)状态，即与配体结合时，传递积极的信号促进细胞增殖、分化、迁移等;处在关闭(off)状态，即未与配体结合时，则促进细胞的凋亡。因此，无论处在开放还是关闭状态，Netrin－1受体都有活跃的生物学行为。Mehlen等［14］研究表明，在配体 Netrin－1 存在的环境中，DCC蛋白具有抗细胞凋亡的功能;但配体缺乏时(例如转移状态)，DCC蛋白可作为肿瘤抑制蛋白，发挥诱导细胞凋亡的作用。这说明DCC蛋白可能是一种肿瘤转移或局部浸润性生长的抑制因子，而DCC功能的丧失可以增加配体缺乏环境中的细胞生存。Tanaka等［15］将含正常DCC基因的18q导入结肠癌细胞株CoKFU和SW480(两种细胞株中DCC基因表达均明显减少，且有1个等位基因丢失)中，发现上述细胞恢复表达DCC蛋白，并且肿瘤细胞在体外环境下的生长速度及在裸鼠体内的致瘤能力受到抑制。近期研究发现，DCC基因低表达、表达缺失等现象出现在胰腺、卵巢、子宫、乳腺、前列腺、血液系统等多种肿瘤中，与这些肿瘤的发生、发展密切相关［4～9］。由此可见，DCC基因缺失或失活是肿瘤发生、发展的一个促发因素。

ccRCC的发生、进展与复杂的染色体改变不断积累密切相关。目前为止，关于DCC基因在ccRCC组织标本中的研究并不多，并且标本例数较少。Hirata等［16］研究了126例RCC患者基因18q的杂合性缺失(LOH)，其中 LOH 最高频率(13.5%)发生在18q21.3。因此，位于18q21.3的DCC和SMAD4作为候选基因，可能影响RCC的发生、发展。Dekel等［17］应用免疫组化法对94例RCC标本进行检测，并随访了相应患者;结果发现，随访期间RCC死亡患者中DCC蛋白低表达率为63%，而术后无瘤生存患者中只有36%为DCC蛋白低表达。因此，DCC蛋白低表达可能与RCC肿瘤侵袭性、病死率密切相关［18］。

本研究发现，ccRCC组织中DCC阳性表达低于癌旁正常组织;DCC表达与ccRCC的TNM分期、病理分级、区域淋巴结转移、远处转移及大血管浸润相关;DCC阳性和阴性ccRCC患者生存率差异具有统计学意义;DCC表达、TNM分期、肿瘤分级、区域淋巴结转移、远处转移及大血管浸润是ccRCC预后的独立影响因子;提示DCC基因缺失或失活是ccRCC发生、发展的一个促发因素，检测 DCC表达对ccRCC早期诊断、治疗和预后评估有重要意义，其有可能成为一种新的分子标记物，为ccRCC靶向治疗等提供理论基础。

［1］Yao M，Huang Y，Shioi K，etal.Expression of adipose differentiation－related protein:a predictor of cancer－specific survival in clear cell renal carcinoma［J］.Clin Cancer Res，2007，13(1):152－60.

［2］赵振威，李延江.肾细胞癌流行病学的研究进展［J］.山东医药，2013，53(7):95－97.

［3］Sato K，Tamura G，Tsuchiya T，et al.Frequent loss of expression without sequence mutations of the DCC gene in primary gastric cancer［J］.Br JCancer，2001，85(2):199－203.

［4］Mille F，Llambi F，Guix C，etal.Interfering withmultimerization of netrin－1 receptors triggers tumor cell death［J］.Cell Death Differ，2009，16(10):1344－1351.

［5］Bamias A，Yu Z，Weinberger PM，et al.Automated quantitative analysis of DCC tumor suppressor protein in ovarian cancer tissue microarray shows association with beta－catenin levels and outcome in patientswith epithelial ovarian cancer［J］.Ann Oncol，2006，17(12):1797－1802.

［6］李会明，李佩玲，庄如锦，等.DCC基因与妇科肿瘤研究新进展［J］.中国优生与遗传杂志，2007，15(11):128－130.

［7］Hadziavdic＇V，Pavlovic＇－Calic＇N，Eminovic＇I.Microsatellite instability and lossof heterozygosity of tumor suppressor genes in Bosnian patientswith sporadic colorectal cancer［J］.Bosn JBasic Med Sci，2008，8(4):313－321.

［8］Koren R，Dekel Y，Sherman E，etal.The expression of DCC protein in female breast cancer［J］.Breast Cancer Res Treat，2003，80(2):215－220.

［9］Henríquez－Hernández LA，Valenciano A，Foro－Arnalot P，et al.Polymorphisms in DNA－repair genes in a cohort of prostate cancer patients from different areas in Spain:heterogeneity between populations as a confounding factor in association studies［J］.PLoS One，2013，8(7):e69735.

［10］吴文溪，马利民.大肠癌中DCC基因表达缺失及其临床意义［J］.临床肿瘤学杂志，2002，7(6):405－407.

［11］Barberá VM，Martín M，Mariñoso L，et al.The 18q21 region in colorectal and pancreatic cancer:independent loss of DCC and DPC4 expression ［J］.Biochim Biophys Acta，2000，1502(2):283－296.

［12］Fazeli A，Dickinson SL，Hermiston ML，et al.Phenotype ofmice lacking functional Deleted in colorectal cancer(Dcc)gene［J］.Nature，1997，386(6627):796－804.

［13］Chan SS，Zheng H，Su MW，et al.UNC－40，elegans homolog of DCC(Deleted in Colorectal Cancer)，is required in motile cells responding to UNC－6 netrin cues［J］.Cell，1996，87(2):187－195.

［14］Mehlen P，Fearon ER.Role of the dependence receptor DCC in colorectal cancer pathogenesis［J］.JClin Oncol，2004，22(16):3240－3248.

［15］Tanaka K，Oshimura M，Kikuchi R，etal.Suppression of tumorigenicity in human colon carcinoma cells by introduction of normal chromosome 5 or 18［J］.Nature，1991，349(6307):340－342.

［16］Hirata H，Matsuyama H，Matsumoto H，etal.Deletionmapping of 18q in conventional renal cell carcinoma［J］.Cancer Genet Cytogenet，2005，163(2):101－105.

［17］Dekel Y，Kugel V，Livne PM，etal.DCC protein expression in clear cell renal cell carcinoma［J］.BJU Int，2004，93(6):867－869.

［18］赵振威，李延江，俞亮.肾细胞癌1 068例临床分析［J］.山东医药，2013，53(12):50－51.