姜黄素对阿霉素致大鼠心脏毒性的保护作用及机制探讨

(宜兴市人民医院，江苏宜兴，214200)

阿霉素(ADR)属于蒽醌类抗生素，被认为是最有效的蒽环类广谱抗癌药物之一。然而，ADR在抗肿瘤的同时具有严重的心脏毒性，临床应用受到限制［1］。ADR的心脏毒性机制尚未完全明确，然而近期研究表明［2，3］，其心脏毒性与心肌组织大量的自由基生成和脂质过氧化引起心肌细胞凋亡有关。姜黄素是从姜科植物姜黄中提取的天然色素，为姜黄的主要活性成分。姜黄素具有抗炎、保肝利胆、抗血脂、抗氧化、抗肿瘤及抗炎等诸多药理作用［4］。近期研究［5，6］表明，姜黄素对缺血和炎症引起的心脏功能损害具有保护作用。2013年5～6月，我们建立大鼠ADR急性心脏毒性模型，检测心脏组织中丙二醛(MDA)水平、超氧化物歧化酶(SOD)活性及凋亡相关蛋白Caspase-3和Bcl-2水平，以探讨姜黄素对ADR致心脏损伤的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料 普通级雄性SD大鼠，体质量220～240 g，由徐州医学院实验动物中心提供。药品:姜黄素(Sigma公司)，用含6%(体积分数)乙醇和6%(体积分数)聚乙二醇400的蒸馏水溶解;盐酸多柔米星注射液(浙江海正药业股份有限公司)，采用生理盐水稀释。试剂:乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒、肌酸激酶(CK)试剂盒、肌酸激酶同工酶(CKMB)试剂盒均购于宁波亚太生物技术公司，SOD试剂盒和MDA试剂盒均购自于南京建成生物工程研究所;兔抗大鼠Caspase-3和Bcl-2多克隆抗体购自Cell Signaling公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒、蛋白质分子量标准、Western blot封闭液、一抗稀释液、二抗稀释液和BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒均来自碧云天生物技术研究所。其他均为AR级化学试剂。实验仪器:751G-可见紫外分光光度计(上海分析仪器厂)，高速匀浆机(上海弗鲁克流体机械制造有限公司)，Bio-Rad model 680酶标仪、电泳仪(美国 Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 分组与造模 将40只大鼠随机分为对照组、模型组和姜黄素低、中、高剂量组各8只。模型组和对照组每日给予生理盐水0.02 mL/g灌胃，第5天分别腹腔注射等量生理盐水、盐酸ADR 20 mg/kg。姜黄素低、中、高剂量组造模前分别给予10、20、40 mg/kg姜黄素灌胃，1次/d，连续5 d;于第5天给药1 h后腹腔注射盐酸ADR 20 mg/kg，后继续给药2 d。

1.2.2 血清 LDH、CK、CKMB 测定 造模后72 h，戊巴比妥麻醉动物，腹腔静脉取血;开胸取出心脏，将心脏组织置于－80℃超低温冰箱中保存待用。按试剂盒方法，检测血清LDH、CK、CKMB。

1.2.3 心脏组织中SOD活性及MDA水平检测取心脏组织于冷生理盐水中匀浆，按试剂盒方法进行操作，采用比色法检测SOD活性及MDA水平。

1.2.4 心脏组织Caspase-3和Bcl-2蛋白检测 采用免疫印迹法。提取心脏组织总蛋白，以BCA法进行蛋白定量。各取100μg上清进行SDS-PAGE电泳(浓缩胶50 g/L，分离胶150 g/L)，100 V转移约120 min。取转移后的硝酸纤维素滤膜(NC膜)，加1∶10稀释的丽春红储存液，摇床室温缓摇15 min，去离子水洗3 min×5次。将膜置入Western封闭液中，室温摇床上缓摇封闭2 h，在摇床上快摇洗膜3 min×5次。加特异性一抗，兔抗鼠激活型Caspase-3(1∶1 000)、Bcl-2(1∶500)抗体。膜置于一抗中，4℃ 冰箱过夜孵育，TBST洗膜5 min×3次。分别加特异性二抗，碱性磷酸酶标记的山羊抗兔IgG，膜置于二抗液内室温下孵育2 h，TBST洗膜5 min×3次。然后TBS洗膜5 min×3次，置BCIP/NBT显色液显色。扫描蛋白印迹显影图，利用凝胶自动分析成像Image J软件计算目的蛋白表达的灰度值，蛋白表达量以Caspase-3、Bcl-2和β-actin的光密度比值表示。

1.2.5 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。数据以±s表示，组间比较采用one-way ANOVA分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 姜黄素对大鼠血清心肌酶的影响 见表1。

表1 姜黄素对大鼠血清LDH、CK、CKMB水平的影响(n=8，U/L，±s)

表1 姜黄素对大鼠血清LDH、CK、CKMB水平的影响(n=8，U/L，±s)

注:与对照组比较，*P ＜0.01;与模型组比较，#P ＜0.05，△P ＜0.01

组别LDH CK MDA对照组198.37 ±35.72 386.47 ± 59.62 535.59 ±63.27模型组 423.18 ±43.25*796.34 ±101.55*806.94 ±90.23*姜黄素低剂量组 351.26 ±31.57 565.20 ± 73.59#683.88 ±62.37#姜黄素中剂量组 289.84 ±26.60#512.37 ± 65.24△ 619.30 ±57.25△姜黄素高剂量组 234.42 ±29.93△ 505.87 ± 73.17△ 573.61 ±65.72△

2.2 姜黄素对大鼠心脏组织氧化应激的影响 见表2。

表2 姜黄素对大鼠心脏组织SOD活性及 MDA 水平的影响(n=8，±s)

表2 姜黄素对大鼠心脏组织SOD活性及 MDA 水平的影响(n=8，±s)

注:与对照组比较，*P ＜0.01;与模型组比较，#P ＜0.05，△P ＜0.01

组别 SOD(U/g prot) MDA(mol/g prot)189.41 ±38.60 2.80 ±0.80模型组 102.10 ±24.31* 6.53 ±1.62*姜黄素低剂量组 126.31 ±21.37# 4.95 ±1.47#姜黄素中剂量组 142.31 ±23.58# 3.92 ±1.30△姜黄素高剂量组 159.09±29.71△ 3.25±1.36对照组△

2.3 姜黄素对大鼠心脏组织Caspase-3和Bcl-2蛋白表达的影响 见表3。

3 讨论

ADR可引起心肌损害，且前期研究发现，ADR引起心肌损害的组织学变化与人类心肌病心脏损害相似［2］。本研究采用大鼠构建ADR心肌损害模型，结果发现，姜黄素对ADR所致心肌损害具有保护作用，抑制血清中心肌酶水平的升高，减轻心脏组织的氧化应激，而且抑制心脏组织Caspase 3蛋白表达的升高，上调Bcl-2蛋白的表达。

表3 姜黄素对大鼠心脏组织Caspase 3及 Bcl-2 表达的影响(n=4，±s)

表3 姜黄素对大鼠心脏组织Caspase 3及 Bcl-2 表达的影响(n=4，±s)

注:与对照组比较，*P ＜0.01;与模型组比较，#P ＜0.05，△P ＜0.01

Caspase-3 Bcl-2对照组组别0.13 ±0.03 0.79 ±0.21模型组 0.37 ±0.08* 0.11 ±0.02*姜黄素低剂量组 0.22 ±0.04# 0.47 ±0.08#姜黄素中剂量组 0.20±0.05△ 0.53±0.14△姜黄素高剂量组 0.17±0.02△ 0.73±0.17△

血清中LDH、CK和CKMB水平能够反映心肌细胞的损伤，ADR引起心肌细胞损伤或者死亡，可导致血清中 LDH、CK和 CKMB水平显著升高［7］。因此，通过测定上述血清心肌酶的活性，可以评价ADR引起的心肌细胞损伤程度以及药物的保护作用。本研究结果显示，ADR显著升高了大鼠血清中LDH、CK和 CKMB活性，与前期研究结果相一致［8，9］。提示姜黄素对ADR导致的心肌损伤具有保护作用。

此外，ADR的心脏毒性与过量自由基的生成有关。ADR的半醌结构可引起线粒体呼吸链脱偶联，诱导自由基的大量生成，而心肌组织中抗氧化酶不足以清除过量生成的自由基，最终导致心肌细胞脂质过氧化和细胞能量代谢紊乱［10～12］。本研究结果发现，ADR导致心脏组织MDA水平升高，SOD活性降低，这进一步证实了氧化应激和自由基过量形成参与了 ADR引起的心脏毒性。然而，姜黄素对ADR致心脏组织MDA水平升高和SOD活性降低具有明显的抑制作用，提示姜黄素的心肌保护作用与抑制ADR引起的氧化应激有关。

同时，机体内氧化应激与细胞凋亡有密切联系［13～15］。当机体处于氧化应激状态时，细胞内ROS水平相对升高，可启动氧化应激链式反应，易于细胞膜上的各种不饱和脂肪酸及胆固醇反应，导致细胞凋亡。本研究发现，ADR可致心脏组织凋亡蛋白Caspase-3蛋白表达增加，Bcl-2蛋白表达降低，而姜黄素显著抑制了ADR导致的Caspase-3蛋白表达上调，并上调了Bcl-2蛋白表达。因此，我们推测姜黄素对ADR导致的大鼠心肌损伤具有保护作用，其保护作用的机制与减少心脏组织MDA过量生成、抑制氧化应激、减轻心肌细胞凋亡有关。

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