常用外周血DNA提取方法的比较

张书广 李秀昌

（山东省聊城市人民医院,山东 聊城 252000）

常用外周血DNA提取方法的比较

张书广 李秀昌

（山东省聊城市人民医院,山东 聊城 252000）

目的比较目前常用的外周血DNA提取的三种方法。方法用三种方法提取全血DNA，通过吸光度检测、PCR扩增分析各自优缺点。结果三种方法提取的DNA纯度和作为模板PCR扩增无显著差别，只是操作时间和成本不同。结论天根离心柱型试剂盒应用比较广泛，Promega试剂盒操作时间最短，Chelex-100方法最经济，适合微量提取。

全血；基因组DNA；提取方法

基因组DNA作为遗传物质的载体,在人类疾病微观研究领域方面是常用的研究工具。有些疾病可以通过对DNA的分析进行诊断,其中广泛使用的就是实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）技术,其定量性能主要取决于样本核酸的提取效率、引物的序列以及扩增反应的条件[1],为了获得高质量的荧光定量PCR结果需要高质量的DNA模板。然而不同DNA提取方法的提取效能和操作有较大差异,且因实验目的和条件的不同,选择的方法也不尽相同。本次研究选择了广泛使用的三种外周血DNA提取方法,包括:promega公司的DNA提取试剂盒、天根公司的离心柱型DNA提取试剂盒以及chelex-100提取方法。实验选取管家基因GAPDH了进行SYBRGreen荧光PCR分析,比较三种提取方法操作时间、提取效率、扩增Ct值等因素,为片段扩增所选用的试剂盒提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

①实验仪器:荧光定量PCR仪型号eppendorf realplex4,Thermo Nan-odrop 2000c 超微量紫外分光光度计。②实验试剂:PCR试剂购自上海生工生物技术有限公司,chelex-100 购自Bio-Rad公司,按5%浓度配制。promega公司的DNA 提取试剂盒、天根公司的离心柱型DNA提取试剂盒购自代理公司。引物由上海生工生物技术有限公司合成。③样品:外周血由志愿者提供。

1.2 方法

1.2.1 promega公司试剂盒法与天根离心柱型试剂盒:参照试剂盒内提供的说明书严格进行提取。

1.2.2 chelex-100提取方法:取10 µL人外周血加入1.5 mL离心管中,加1 mL灭菌蒸馏水,混匀,冰上放置15 min,破红细胞13000 rpm离心3 min,去上清,收集白细胞沉淀,移取200 µL 5% Chelex-100溶液（5% Chelex-100为悬浊液,用前充分振摇）加至含白细胞沉淀的离心管中,充分振荡,56 ℃水浴30 min,取出振荡,置100 ℃水浴8 min,取出振荡,冰上放置3 min,13000 rpm离心3 min,上清作模板用于PCR扩增。

1.2.3 DNA含量和纯度检测:各取1 µL三种方法提取的基因组DNA样品,以无菌水为空白对照,紫外分光光度计测定基因组DNA的含量（ng/L）及波长为260 nm和280 nm的吸光度值（A260、A280）。根据A260/A280的比值来判断DNA的纯度:A260/A280＜1.8说明样品中存在蛋白质污染,A260/A280介于1.8～1.9之间说明样品较纯,A260/ A280＞1.9说明样品中存在RNA污染。

1.2.4 体外PCR扩增:根据GenBank中人三磷酸甘油醛基因（GAPDH,基因登录号:NM_002046）第8外显子的核苷酸序列,用 Primer5.0软件设计引物序列进行该基因片段的扩增[4]。上游引物:5' GGC AAG GTC ATC CCT GAG 3',下游引物:5' GCCTGC TTC ACC ACC TTC 3'。PCR扩增体系:DNA含量50 ng,上游和下游引物各2 µL,Taq PCR SYBRGreenMix 12.5 µL,补加ddH2O至总体系25 µL。反应条件:94 ℃ 5 min预变性,94 ℃30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 20 s、循环35次,72 ℃采集荧光,读取CT值。

2 结 果

2.1 三种方法提取的基因组DNA结果。见表1。

表1 三种方法提取的基因组 DNA各项指标比较

经统计学分析,三种方法两两比较,DNA纯度差异无统计学意义（P＞0.05）。因为每种方法的用样量不同,最终的溶解体积也不同,浓度没有做统计学比较。

2.2 PCR扩增结果

三种方法扩增GAPDH基因结果良好。CT值见表2。

表2 三种方法提取的基因组DNA荧光PCR扩增CT值

3 讨 论

全血是基因组DNA提取的常用试验材料。目前基因组DNA提取的方法有很多种,如酚氯仿法、异硫氰酸胍法、固相吸附法、盐析法和碘化物法等[3-5]。作为基因研究的关键步骤,基因组DNA的提取和纯化一直都是一个耗时耗力并且自动化程度不高的过程,因而如何快速、经济的获得高品质的基因组DNA就具有十分重要的意义。这些方法中有的操作繁杂,有的加入了对人体和环境有害的物质。所以要根据实验要求系统地考察方法的提取效率、操作时间、使用成本等因素。

本次选择的三种提取方法是目前最常用的方法类型。结果显示三种方法提取的纯度无显著差别,都取得了较好的效果。Promega试剂盒操作时间最短,与Chelex-100方法相差半小时,对时间要求严格的可以选择。天根离心柱型试剂盒价格比较便宜,适合多种后续实验,应用很广泛。如大标本量只考虑成本,Chelex-100方法是很好的选择,它在提取微量样本中很有优势,只需要几微升全血,就能得到质量很高的DNA,目前在法医鉴定中广泛应用。

随着核酸检测需要的日益增加,市场上可供使用的提取试剂盒也逐渐增多,使用者应根据样本的实际情况和使用目的综合考虑。本研究结果以期对选择合适的提取试剂盒起到一定的参考作用。

[1] 陈碧艳,覃茜,李金花.改良外周血DNA提取方法的效果分析[J].广西医学,2011,33(10):1364-1366.

[2] 李晓晓,赵焕英,杨云廷,等.三种人全血基因组DNA 提取方法的比较[J].现代生物医学进展,2013,27(13):5221-5225.

[3] 张帅,徐锐,张强,等.改良盐析法提取全血基因组DNA的影响因素研究[J].中国现代医学杂志,2012,22(35):42-46.

[4] 杨泽民,罗少洪,陈耕夫.三种全血基因组DNA提取方法的比较[J].中国实用医药,2009,4(12):13-14.

[5] 贾二娟,朱伟锋,余乐涵.蛋白酶K对盐析法提取全血DNA的影响[J].实验与检验医学,2011,29(3):263-264.

R446.9

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1671-8194（2014）25-0088-02