非酒精性脂肪性肝病患者血清和肝组织胰腺衍生因子水平变化及意义

杨帆，李良平

·脂肪性肝病·

非酒精性脂肪性肝病患者血清和肝组织胰腺衍生因子水平变化及意义

杨帆，李良平

目的研究胰腺衍生因子（PANDER）在非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）患者血清和肝组织的水平。方法纳入经肝组织病理学活检证实的NAFLD患者41例，以及20例正常人（NC），根据NAFLD活动性积分（NAS），将NAFLD患者分为单纯性脂肪肝（NAFL）10例和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）31例。采用ELISA法检测受试者血清和肝组织PANDER水平；采用实时荧光定量PCR法检测肝组织PANDER mRNA水平的变化。另外，收集所有研究对象的人体测量学、生化及代谢指标，分别比较PANDER水平及与其相关性。结果NAFLD患者血清PANDER水平为（3.38±1.99）ng/ml，较NC组[（0.94±0.60）ng/ml]升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；NAFLD患者肝组织PANDER水平为（3.27±2.49）ng/ml，显著高于NC组[（0.98±0.73）ng/ml，P＜0.05]；NAFL组和NASH组血清PANDER水平分别为（3.42±2.39）ng/ml和（3.36±1.91）ng/ml，肝组织PANDER水平分别为（2.33±1.52）ng/ml和（3.58±2.68）ng/ml，差异无统计学意义；血清PANDER与肝组织PANDER水平、BMI、腰围、臀围、TG、FBG、FINS、HMOA-IR的相关系数分别0.425、0.643、0.637、0.375、0.411、0.487、0.512和0.547，均呈正相关关系（P＜0.05），与IAI（r=-0.544）、HDL-C（r=-0.396）呈负相关（P＜0.05）；肝组织PANDER水平与血清PANDER水平、BMI和腰围的相关系数分别为0.425、0.379和0.427，也呈正相关（P＜0.05）。结论PANDER可能通过影响胰岛素抵抗和糖脂代谢参与NAFLD的发生与发展。

非酒精性脂肪性肝病；胰腺衍生因子；胰岛素抵抗；脂质；糖代谢

【Key word】Nonalcoholic fatty liver diseases；Pancreatic derived factor；Insulin resistance；Lipid；Glucose metabolism

在非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）发病机制中，胰岛β细胞功能受损及胰岛素抵抗起了很重要的作用，但它们与肝脏脂质沉积的关系仍不是很清楚。既往动物试验研究显示，外源性胰腺衍生因子（Pancreatic derived factor，PANDER）作为胰岛分泌的细胞因子样蛋白在小鼠肝组织过表达时，血清甘油三酯（TG）水平增加，同时肝脂质沉积也增加，通过干预后随着肝脏脂质沉积减轻，PANDER表达也下降，推测PANDER可能参与了肝脏异常脂质沉积的过程[1]。然而，迄今为止，很多有关脂肪肝的研究只集中在体外试验或动物试验，临床资料很少。本研究旨在检测PANDER在脂肪肝病人血清和肝组织的水平，以及分析PANDER与一些糖脂代谢和胰岛素抵抗的关系，初步探讨PANDER在NAFLD发生发展机制中的作用,从而为临床预防和治疗NAFLD提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 研究对象自2012年3月～2012年9月于我院就诊的符合中华医学会肝脏病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组2010年发布的《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南（2010年修订版）》[2]诊断标准的、经肝脏病理学活检证实为NAFLD患者，排除可导致脂肪肝的其他特定疾病和2周内服用过利尿剂、β受体阻滞剂、降脂药和皮质激素等影响糖代谢和脂代谢药物以及服用过保肝药物治疗的患者。病理学诊断参照美国国立卫生研究院非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）临床研究网病理工作组指南，常规进行NAFLD活动度积分(NAFLD activity score，NAS)和肝纤维化分期[3]。在41例NAFLD患者中，根据NAS积分和肝纤维化分期，分为单纯性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver，NAFL）患者10例，男6例，女4例。平均年龄（47.0±15.1）岁；NASH患者31例，男性19例，女性12例。平均年龄（45.8±9.4）岁。另招募年龄和性别相匹配的无肝脏疾患的志愿者（normal control,NC）20例，男性9例，女性11例。平均年龄（43.4±11.4）岁。所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 人体测量学指标测量身高和体质量、腰围、臀围、血压、计算体质量指数[BMI=体质量/身高2（Kg/m2）]、胰岛素抵抗采用稳态模型（homeostatic model assessment index，HOMA-IR）[HMOA-IR= FPG（mmol/l）×FINS（uU/ml）/22.5]和胰岛素敏感指数[IAI=1/（FPG×FINS）]。

1.3 血生化及代谢指标的检测研究对象空腹（空腹时间＞8 h），清晨时于肘静脉抽取空腹静脉血，采用速率散射比浊法检测血生化指标和血总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）；常规检测乙型和丙型肝炎病毒抗原抗体（芬兰Orion Diagnostica公司试剂）；采用化学发光微粒子免疫分析法测定空腹血糖（FBG）、空腹胰岛素（FINS，美国雅培公司试剂盒）；另取血，离心后，留取血清于Eppendorf管，置-80℃超低温冰箱分装保存，用于血清PANDER的统一测定。

1.4 血清PANDER测定采用ELISA法（上海蓝基生物科技有限公司）。根据公式y=0.0752X+0.2146，计算出各样本水平。

1.5 肝组织PANDER mRNA检测行经彩超引导下经皮肝脏穿刺活检术或腹腔镜下肝脏活检术，术前征得受试者同意并签署知情同意书。将肝组织置于10%福尔马林中固定，另取肝组织置于Trizol液中，立即放入-80℃超低温冰箱保存。检测PANDER基因引物设计：上游引物，5'-GTGGTGTTCGTGGTCTTCG-3'，下游引物，5'-TTTGGCGTACTTGCTTCTGC-3'；以GAPDH作为内参照，内参GAPDH引物设计：上游引物，5'-GGTGAAGGTCGGAGTCAACGGA-3'，下游引物，5'-GAGGGATCTCGCTCCTGGAAGA-3'。采用Trizol法提取肝组织总RNA（美国Invitrogen公司），每个样本分别取总RNA 5 μl于EP管中，加入Buffer缓冲液1 μl，混匀充分后，将混合液加入预先配置好的1.5%琼脂糖凝胶，另取DM200 Marker 5 μl于1.5%琼脂糖凝胶、电泳。使用超微分光光度计测量每个样本RNA水平，检测各样本D260/D280比值，计算RNA纯度。以逆转录所得cDNA为模板，应用实时荧光定量PCR技术检测PANDER及内参GAPDH mRNA水平。在反应完成后，记录各反应孔的阈值循环数（threshold cycle），即Ct值。采用定量PCR法中的相对定量法计算各样本的△Ct值=（CtPANDER-CtGAPDH），△△Ct=（CtPANDER-CtGAPDH）NAFLD-（CtPANDERCtGAPDH）NC，倍数的变化用F=2-△△Ct[27]法计算（F表示NAFLD患者肝脏组织中目标基因PANDER水平相对于NC肝脏组织的变化倍数）。

1.6 统计学处理采用SPSS19.0统计软件包进行处理，所有数据先进行正态检验及方差齐性检验，对符合正态分布且方差齐性的或者经对数转化后符合正态分布或者方差齐性的两独立样本，以（±s）表示，采用t检验；对不符合正态分布或者方差不齐的两独立样本，以[中位数（四分位数间距）]表示，采用秩和检验；PANDER与单个自变量的相互关系采用Spearman相关分析。P＜0.05被认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组肝组织PANDER mRNA水平变化见图1。

图1 肝组织PANDER mRNA水平变化M：内参GAPDH；1、2：NC组；3、4：NAFL组；5、6：NASH组

2.2 NAFLD患者与正常人血清和肝脏PANDER水平比较见表1。与正常组比较，NAFLD组血清和肝组织PANDER水平明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 两组血清和肝组织PANDER水平（±s）的比较

表1 两组血清和肝组织PANDER水平（±s）的比较

①P＜0.01

例数血清PANDER（ng/ml）肝组织PANDER（ng/ml）NAFLD413.38±1.99①3.27±2.49①NC200.94±0.600.98±0.73

2.3 NAFL与NASH患者血清和肝脏PANDER水平比较见表2。两组血清和肝组织PANDER水平无统计学差异（P＞0.05）。

表2 两组血清和肝组织PANDER水平（±s）的比较

表2 两组血清和肝组织PANDER水平（±s）的比较

例数血清PANDER（ng/ml）肝组织PANDER（ng/ml）NAFL103.42±2.392.33±1.52 NASH313.36±1.913.58±2.68

2.4 NAFLD组与NC组人体测量学指标、血生化和代谢指标的比较见表3、表4。与NC组比较，NAFLD组年龄、性别、身高差异无统计学意义（P＞0.05）；NAFLD组BMI、腰围和臀围明显升高（P＜0.05）；血生化和血脂水平也明显升高。

2.5 NAFLD组与NC组代谢指标的比较见表5。与NC组比较，NAFLD组FBG、FINS、HOMA-Index水平升高，IAI下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3 NAFLD患者与正常人人体测量学指标[中位数（四分位数间距）]的比较

表4 NAFLD组与NC组生化指标（±s）的比较

表4 NAFLD组与NC组生化指标（±s）的比较

①P＜0.01

例数AST（U/L）ALT（U/L）TG（mmol/）TC（mmol/L）LDL-C（mmol/L）HDL-（mmol/L）NFLD4139.60±14.33①46.95±21.431.94±0.95①4.59±0.712.65±0.60①1.22±0.28 NC2028.25±6.5646.95±21.431.30±0.984.01±0.471.96±0.471.26±0.19

表5 NAFLD组与NC组糖代谢指标（±s）的比较

表5 NAFLD组与NC组糖代谢指标（±s）的比较

②P＜0.01

例数FBG（mmol/L）FINS（Uu/ml）HOMA-IRIAI NAFLD415.79±1.15①8.82±6.34①2.31±1.68①0.02（0.02，0.04）①NC204.93±0.644.65±1.121.03±0.330.04（0.04，0.06）

2.6 血清和肝组织PANDER水平与临床指标的相关性分析分析表明，血清PANDER与肝组织PANDER、BMI、腰围、臀围、TG、FBG、FINS、HMOA-IR呈正相关（P＜0.05），与IAI、HDL-C呈负相关（P＜0.05），与其他指标无明显相关性（P＞0.05）；肝组织PANDER与血清PANDER、BMI、腰围呈正相关（P＜0.05），与臀围、TC、TG、LDL-C、HDL-C、FGB、FINS和HOMA-IR无显著相关性（P＞0.05），见表6和表7。

表6 血清PANDER与相关指标的相关性分析

表7 肝组织PANDER与临床指标之间的相关性分析

3 讨论

人PANDER基因在X染色体上定位于21q22、 D21S266和D21S1259之间，包含8个外显子。PANDER启动子具有组织特异性，在胰岛和肝源性细胞系表达[4]，其蛋白相对高水平的表达于胰岛β细胞[5]，与胰岛素一起受到血糖的调节而共同分泌[6]。研究显示，PANDER升高可以诱导胰岛β细胞凋亡、抑制胰岛素分泌和诱导肝细胞胰岛素抵抗[7～9]。Yang et al用体外125I-PANDER竞争结合试验证明，125I-PANDER呈剂量依赖性和时间依赖性地结合在肝细胞膜上，抑制胰岛素信号转导，诱导肝胰岛素抵抗[10]。糖尿病db/db小鼠PANDER mRNA和蛋白质水平是非糖尿病db/m小鼠的2.5倍，循环血RANDER水平也明显升高，使用4周胰岛素增敏剂罗格列酮后，胰岛的PANDER表达较前明显下降[11]。在肥胖和高脂饮食小鼠肝脏，PANDER的表达显著上升，而通过7周的强制减肥运动，随着小鼠肝细胞脂肪变程度减轻，胰岛素抵抗改善，肝脏PANDER表达量也随之明显降低[12]。通过siRNA介导的方法特异性敲除同时具有胰岛素抵抗、高甘油三脂血症和脂肪肝的db/db小鼠肝脏PANDER基因，结果发现，小鼠脂肪肝形态学明显改善、肝组织中脂质沉积和血清甘油三酯水平显著降低，Akt的活性增强，与胰岛素信号转导密切相关的蛋白激酶B和一磷酸腺苷活化蛋白激酶活性以及FoxO1活性被明显抑制。这些实验结果表明，PANDER参与了机体糖脂代谢调节和肝脂肪变的发生。

除动物试验及体外试验外，PANDER是否也通过类似途径参与人体NAFLD的发病机制呢？本实验结果显示NAFLD患者肝组织和血清PANDER水平较正常对照组升高，且肝组织PANDER与血清PANDER、BMI、腰围呈正相关；血清PANDER与BMI、腰围、臀围、TG、FBG、FINS、HMOA-IR、IAI呈正相关。进一步提示PANDER可能是诱导机体发生胰岛素抵抗（IR），调节脂质代谢的一个重要的内源性因素，从而参与了NAFLD的发病机制。

本实验结果显示NAFLD组血清PANDER与FINS和HOMA-IR明显相关，表明PANDER可能参与诱导IR的发生过程，可能在NAFLD的发病机制中起着一定的作用。分析PANDER诱导机体发生IR的可能机制是：（1）重组PANDER可以与肝细胞膜上某种蛋白质结合，通过抑制胰岛素受体酪氨酸磷酸化和胰岛素信号转导，诱导肝细胞胰岛素抵抗的发生[13]；（2）过表达PANDER基因可以通过激活FoxO1的活性来抑制胰岛素信号转导，诱导IR的发生[14]。通过重组PANDER蛋白预处理或过表达PANDER均能以时间及剂量依赖的方式显著地诱导人、大鼠及小鼠胰岛细胞、β细胞系及α细胞系凋亡，并抑制β细胞分泌胰岛素，从而诱导IR[10]；（3）PANDER高水平表达对肝脏及脂肪组织的胰岛素敏感性有重要的调节作用[11]。本实验结果显示，NAFLD组FPG、TC、TG、LDL-C比正常对照组水平升高，且相关性分析显示，血清PANDER与FBG成正相关（P＜0.05），提示PANDER过表达可能通过诱导机体发生糖代谢紊乱参与NAFLD的发病机制。PANDER可能参与调节脂质代谢，其机制可能是：（1）在PANDER过表达情况下，FoxO1在肝脏异常脂质沉积中起重要作用[15，16]。其中一个最主要的调节形式就是Akt-FOXO1途径和Akt介导FOXO1磷酸化，使FOXO1转录活动停止[17]；（2）在过表达PANDER的小鼠，以过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs）及固醇调节元件结合蛋白-1代表的脂质合成代谢通路中的转录因子和关键酶在转录和翻译水平有显著的增加，而在肝细胞与脂质分解代谢相关的转录因子和关键酶的蛋白表达则明显被抑制。

总之，PANDER与糖脂代谢、胰岛素抵抗和肝脂肪沉积关系密切，动物实验也发现干预PANDER表达可以减轻肝组织异常脂质沉积，这为糖尿病、高脂血症和非酒精性脂肪性肝病提供了一个新的靶点。

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（收稿：2014-01-14）

（校对：陈从新）

Serum and hepatic level of pancreatic derived factor in patients with non-alcoholic fatty liver diseases

Yang Fan，Li Liangping.Department of Gastroenterology，Provincial People’s Hospital，Chengdu 610072，Sichuan Province，China

ObjectiveTo explore the serum and hepatic level of pancreatic derived factor（PANDER）in patients with non-alcoholic fatty liver diseases（NAFLD）.MethodsForty-one patients with NAFLD confirmed by liver biopsy and 20 healthy persons were included in this study and the patients with NAFLD were further divided into NAFL group（n=10）and NASH group（n=31 cases）according to the NAFLD activity score（NAS）. Serum and hepatic level of PANDER were detected by ELISA method and hepatic level of PANDER mRNA was determined by real-time PCR.Anthropometry data，biochemical and metabolic parameters of all subjects were collected and compared between different groups.ResultsThe serum level and hepatic level of PANDER in patients with NAFLD were（3.38±1.99）ng/ml and（3.27±2.49）ng/ml，respectively，significantly higher than those in healthy controls[（0.94±0.60）ng/ml，（0.98±0.73）ng/ml），respectively，P＜0.05]；No significant difference in serum level[（3.42±2.39）ng/ml vs.（3.36±1.91）ng/ml]and hepatic level[（2.33±1.52）ng/ml vs.（3.58±2.68）ng/ml]of PANDER between patients with NAFL and NASH；Serum level of PANDER were positively correlated with hepatic level of PANDER（r=0.425），BMI（r=0.643），waist circumference（r=0.637），hip circumference（r=0.375，triglyceride（r=0.411），fasting blood glucose（r=0.487），fasting insulin（r=0.512）and homeostasis model assessment index（HOMA-IR，r=0.547，P＜0.05），and negatively correlated with insulin action index（r=-0.544）and high-density lipoprotein cholesterol（r=-0.396，P＜0.05）.Hepatic level of PANDER were positively correlated with serum PANDER level（r=0.425），body mass index（r=0.379）and waist circumference（r=0.427，P＜0.05）.Conclusion PANDER plays an important role in the pathogenesis of NAFLD by affecting body insulin resistance and glucose and lipid metabolisms.

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.05.009

610072成都市电子科技大学医学院附属四川省人民医院消化科

杨帆，女，27岁,硕士研究生。主要从事肝病防治研究。E-mail:fanfancool.5128@yahoo.com.cn

李良平，E-mail:llp0131@medmail.com.cn