高速逆流色谱法分离绿茶中的化学成分

王 尉，林 楠，乐胜锋，王 覃，周晓晶，赵新颖，杜 宁，张经华

（北京市理化分析测试中心，北京 100089）

茶叶在我国有数千年的饮用历史，同时历代药书中也有茶叶入药的记载。通过研究表明，茶不仅能止渴、提神醒脑、消除疲劳，还具有抗衰老、抗辐射、抗菌消炎、降低血糖血脂、防治心脑血管病等多种生理功能。茶多酚作为是茶叶中重要的活性成分，其在茶叶中含量很高，约占茶叶干质量的25%～35%，主要含有6 类成分：黄烷醇类、4-羟基黄烷醇类、花色苷类（花青素类、花白素类）、黄酮类、黄酮醇类和酚酸及缩酚酸类。其中以黄烷醇类（主要是儿茶素类化合物）最为重要，占茶多酚总量的60%～80%。儿茶素不仅仅对茶叶的滋味具有重要的作用，而且大量的研究表明儿茶素还具有重要的生物活性，在抗氧化、清除自由基[1-4]、抗辐射[5]、抗病毒[6-7]、抗菌消炎[8-9]、降血压血脂[10-14]和预防癌症[15-20]等方面具有重要的功能。

高速逆流色谱（high-speed countercurrent chromatography，HSCCC）作为20世纪70、80年代间发展起来的一种连续高效的液-液分配色谱分离技术[21-22]，结合了液-液萃取和分配色谱的优点，是一种无需任何固态载体或支撑的液-液分配色谱技术。其根据样品在两相中分配系数的不同达到样品之间相互分离的目的。HSCCC具有无不可逆吸附、回收率高、进样量大[23]等特点。该技术在绿茶化学成分分离中也得到了较好的应用。Cao Xueli等[24]对绿茶提取物进行两步HSCCC分离，可以得到EGCG、GCG、ECG 3 种儿茶素成分。成超等[25]采用高效逆流色谱（high-performance countercurrent chromatography，HPCCC）对儿茶素粗品进行分离，在120 min内一次制备即可得到儿茶素和表儿茶素两种儿茶素异构体。但是，尚未有绿茶活性成分HSCCC分离纯化方法系统性研究的相关报道。本实验应用HSCCC技术对市售绿茶进行活性成分研究，通过对绿茶有效部位的分段萃取和多种HSCCC溶剂系统的分离，共得到8 种高纯度单体化合物，具有较好的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、正己烷、甲醇、磷酸（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；甲醇（色谱纯） 美国Fisher scientific公司；咖啡碱（caffeine，CFA）、表没食子儿茶素（epigallocatechin，EGC）、表儿茶素（epicatechin，EC）、儿茶素（catechin，C）、表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、没食子儿茶素没食子酸酯（gallocatechin gallate，GCG）、表儿茶素没食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、没食子酸（gallic acid，GA）（对照品） 上海融禾医药科技有限公司；龙井绿茶 北京吴裕泰茶业股份有限公司。

1.2 仪器与设备

TBE-300B半制备型高速逆流色谱仪 上海同田生物技术有限公司；LC-20A高效液相色谱仪（配SPDM20A检测器） 日本Shimadzu公司；ALPHA 1-2 plus冷冻干燥机 德国Christ公司。

1.3 方法

1.3.1 对照品溶液配制

称取CFA、EGC、EC、C、EGCG、GCG、ECG、GA对照品各10 mg分别置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，可得1 mg/mL对照 品溶液。再从其中分别吸取1 mL溶液置于10 mL容量瓶中，稀释至刻度，即单个对照品的质量浓度均为0.1 mg/mL。

1.3.2 高效液相色谱条件

Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.2%磷酸溶液（A）-甲醇（B），线性梯度洗脱，20%～80% B（0～30 min），流速：1 mL/min；检测波长：274 nm；柱温：30℃。

1.3.3 样品的提取

将绿茶粉碎过0.3 mm筛，称取绿茶粉末200 g，加入80%乙醇2 L，60 ℃回流提取3 次，每次1 h，过滤，合并滤液，减压回收乙醇得提取物浸膏。所得浸膏用蒸馏水分散，分别用二氯甲烷和乙酸乙酯萃取3 次，合并萃取液，减压回收溶剂得二氯甲烷和乙酸乙酯浸膏，备用。剩余水相蒸干，备用。

1.3.4 溶剂选择和高速逆流色谱操作过程

对于绿茶中儿茶素等化学成分的HSCCC分离均采用乙酸乙酯-水的中等极性溶剂体系，根据待分离化合物的极性进行辅助溶剂的选择。对于极性较大的EGC和CFA采用正丁醇-乙酸乙酯-水的极性溶剂体系；对于EC、C、EGCG、GCG等儿茶素类成分，可按照化合物的极性强弱调节溶剂体系中正己烷的比例，以到达良好的分离效果。

将选定的溶剂体系充分混合后，静置分层，上相为固定相，下相为流动相。先以10 mL/min的流速泵入固定相，待固定相充满管道后。打开主机调整转速为900 r/min，主机正转，当达到设定转速时，以2 mL/min的流速泵入流动相。主机温度控制在25 ℃，检测波长设定为280 nm，当流动相从主机出口流出时进样。

2 结果与分析

2.1 绿茶的提取

对绿茶粉末采用80%乙醇，料液比1:10（g/mL），60 ℃回流提取1 h，滤渣重复2 次，合并滤液，减压浓缩，所得浸膏在60 ℃烘箱中干燥至恒质量，计算样品浸膏的提取率为13.8%。通过对绿茶提取物和混合对照品溶液进行HPLC分析，如图1所示，结果表明绿茶中以儿茶素为主要的活性成分均已被提取出来。

图 1 绿茶提取物（A）对照品（B）HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of reference standards

2.2 绿茶化学成分分离纯化

对二氯甲烷萃取物采用正丁醇-乙酸乙酯-水（0.2∶1∶2，V/V）溶剂体系进行HSCCC分离，可得到CFA，如图2、3所示。对乙酸乙酯部位首先采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（0.8∶5∶1∶5，V/V）溶剂体系进行第1次HSCCC分离，将收集的组分分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，其中第Ⅳ组分为ECG（如图4、5），对Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分进行第2次HSCCC分离，溶剂体系分别为正丁醇-乙酸乙酯-水（0.2∶1∶2，V/V）、正己烷-乙酸乙酯-水（1∶20∶20，V/V）、正己烷-乙酸乙酯-水（1∶8∶8，V/V），可得到EGC、EC、C、EGCG、GCG，见图6～11。对水相萃取物采用乙酸乙酯-乙醇-水（5∶0.5∶ 6，V/V）溶剂体系进行HSCCC分离，可得到GA，如图12、13所示。

图 2 二氯甲烷萃取物的HSCCC色谱图Fig.2 HSCCC chromatogram of dichloromethane extract

图 3 二氯甲烷萃取物纯化后HPLC色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of purified dichloromethane extract

图 4 乙酸乙酯萃取物HSCCC色谱图Fig.4 HSCCC chromatogram of ethyl acetate extract

图 5 乙酸乙酯萃取物纯化后HPLC色谱图Fig.5 HPLC chromatograms of purified ethyl acetate extract and purified fractions

图 6 峰Ⅰ的HSCCC色谱图Fig.6 HSCCC chromatogramof peakⅠ

图 7 峰Ⅰ纯化后EGC的HPLC色谱图Fig.7 HPLC chromatogram of purified peakⅠ

图 8 峰Ⅱ的HSCCC色谱图Fig.8 HSCCC chromatogram of peak Ⅱ

A.峰Ⅱ纯化后的EC；B.峰Ⅱ纯化后的C；C.峰Ⅱ纯化后的EGCG。

图 10 峰Ⅲ的HSCCC色谱图Fig.10 HSCCC chromatogram of peak Ⅲ

图 11 峰Ⅲ纯化后GCG的HPLC色谱图Fig.11 HPLC chromatogram of purified peak Ⅲ

图 12 水相萃取物的HSCCC色谱图Fig.12 HSCCC chromatogram of water extract

A.水相萃取物；B.纯化后GA。

3 结 论

本实验采用HSCCC的方法，从绿茶原料中分离得到CFA、EGC、EC、C、EGCG、GCG、ECG、GA 8 种单体化合物，其纯度分别为99.5%、97.2%、98.2%、97.6%、98.8%、99.1%、99.2%和98.8%。其中包含EGCG等6 种儿茶素类化合物以及没食子酸和咖啡碱。尤其对于绿茶中含量较低的C（提取物中的质量分数为5‰，下同）、EC（7‰）、EGC（8‰）3 种儿茶素类化合物，通过2 次HSCCC分离，即可得到高纯度单体，该方法简便可行。

HSCCC法较常规柱色谱的分离方法，无需多种固定相填料，仅通过对不同溶剂系统选择便可达到对不同化合物的分离纯化，具有成本低廉、分离快速的优点。因而显示了HSCCC法在天然产物活性成分研究开发中的应用价值，同时，也可为中草药质量控制过程中所需要的高纯度单体的制备提供了一种简单实用的方法。

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