新霉素半定量胶体金试纸条的研制

王丽哲，赵 瑜，唐慧林，王丽丽，于重楠，刘 敏，何艳玲

（1.北京陆桥技术有限责任公司，北京 100123；2.中国检验检疫科学研究院，北京 100123）

新霉素属于常见氨基糖苷类药物之一，在兽医临床饲料添加剂中有广泛应用，对于奶牛乳房炎、子宫内膜炎的治疗上有很都有很好地疗效[1-2]。然而，新霉素对人类具有明显的毒害作用，尤其是耳毒性与肾脏毒性。随着新霉素的大量使用，该药物的残留检测也渐渐被人所重视，国家及欧盟对新霉素的残留有严格要求[3-6]，我国农业部发布的“动物性食品中兽药残留限量”（农业部235号公告）中规定，新霉素在牛乳中残留不能超过500 μg/kg，与欧盟规定的牛乳中新霉素残留最高限量一致。

本研究开发了一种半定量检测牛乳中新霉素的胶体金试纸条，在传统胶体金检测技术[7-9]的基础上加以改进，包含有一条控制线（C线），两条不同限量的检测线T1、T2（均包被目标检测物全抗原），用于牛乳样品中目标残留物的半定量检测。通过牛乳样品中的目标残留物与呈横条状分布于免疫层析膜上的 T1、T2线共同竞争性的与胶体金标记抗体反应，由免疫层析膜上T1、T2线的显色情况来判定待检样品中目标残留物的含量范围，当层析膜上的T1、T2均显色时，说明待检测样品中的残留物含量低于最低检测限；当层析膜上T1、T2线只有一条显色，说明待检测样品中残留物的含量在最低检测限和最高检测限之间；当层析膜上T1、T2线均不显色，仅有C线显色时，说明待检测样品中残留物的含量超过了最高检测限。该新霉素半定量金标快速检测试剂盒，最低检测限为200 μg/kg，最高检测限为400 μg/kg。设定的最低检测限可以满足企业对于优质奶源分级筛选的要求，根据市场调查，客户在选用快速检测产品时，多要求检测灵敏度低于国家标准，故最高检测限400 μg/kg在满足国家对新霉素药物最高残留限量要求的同时，更适合企业实际检测要求。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氯金酸、羊抗鼠抗抗体、新霉素标准品 美国Sigma公司；硝酸纤维素膜、胶体金结合垫、样品垫、吸水垫、塑料背衬 美国Millipore公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 设备与仪器

BioJet XYZ 3050点膜仪 美国BioDot公司；ZQ5000数控斩切机 上海金标生物技术公司；3K15高速低温离心机 美国Sigma公司；BT-47水浴锅 日本Yamato公司；Ic160恒温培养箱 瑞士Salvis公司；HJ-3恒温磁力搅拌器 金坛市科兴仪器厂；FF40冰箱 青岛海尔集团；MDF-192AT冷藏柜 日本Sanyo公司；MS1 Minishaker涡旋振荡器 德国IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 新霉素偶联抗原合成[10-14]

新霉素属于小分子抗原，需要与其他蛋白偶联制备成全抗原方具有免疫原性，并得以竞争法制备胶体金试纸条。称取20 mg新霉素硫酸盐和10 mg牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA），分别溶解于1 mL的蒸馏水中，将BSA溶液逐滴加入到新霉素溶液中，室温下于磁力搅拌器上搅拌2 h以上。取70 mg 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐（1-ethyl-3(3-dimethyllaminopropyl) carbodiie hydrochlide，EDC·HCl）溶于1 mL蒸馏水中，再逐滴加入到上述溶液中，在室温条件下继续搅拌1 h以上，然后于4 ℃放置过夜。用PBS（1 L配方：KH2PO40.27 g、Na2HPO41.42 g、NaCl 8 g、KCl 0.2 g、pH 7.2～7.4）透析3 d后，分装，－20 ℃贮存。

1.3.2 抗体-胶体金标记

1.3.2.1 胶体金溶液的制备

将1 g氯金酸溶于超纯水配制得0.01%的氯化金溶液，取100 mL加热至沸腾，在搅动状态下加入1.5 mL的1%柠檬酸三钠溶液。继续加热煮沸15 min，随后冷却至室温，用超纯水恢复至原体积，在510～550 nm波长范围内测定其最大吸收波长，4 ℃避光保存。

1.3.2.2 最适标记pH值的确定

取15 个1.5 mL试管，分别加入1 mL 制备好的胶体金溶液；用0.1 mol/L K2CO3溶液调节pH值分别为3、4、5、6、7、8、9、10，混合后室温放置10 min；加入质量浓度为0.2 mg/mL的新霉素抗体，每管各60 L，混合后室温放置30 min；观察胶体金颜色变化直到室温条件下放置2 h，仍保持红色，且实验结果符合检测灵敏度的为最低pH值。

1.3.2.3 最低标记蛋白量的确定

取6 个1.5 mL试管，分别加入1 mL 制备好的胶体金溶液；用0.1 mol/L K2CO3溶液调节pH值为最适pH值，混合后室温放置10 min；加入0.2 mg/mL的新霉素抗体，分别为5、1 0、1 5、2 0、2 5、30 L混合后室温放置30 min；加入25 mg/mL聚乙二醇20000封闭，封闭液终质量浓度为4 mg/mL，颜色仍保持红色，且最终检测灵敏度符合实验要求的最小蛋白用量即最小蛋白标记量。

1.3.2.4 抗体-胶体金复合物制备

取已制备好的胶体金溶液50 mL，用0.1 mol/L K2CO3溶液调pH值至最适标记pH值。搅拌中加入抗体至最适标记蛋白量，继续搅拌20 min，加入10% BSA溶液直至BSA的终含量为1%，继续搅拌10 min；在4 ℃、12 000 r/min离心30 min，小心弃去上清液，加入50 mL 0.01 mol/L Tris-HCl溶液（pH 8.2，含1% BSA，简称TBS）再重复清洗一次，最后用100 mL 0.01 mol/L TBS将沉淀重悬，0.22 μm微孔滤膜过滤，按照2 mL量包被1 cm×30 cm玻璃纤维，37 ℃恒温培养箱2 h，烘干备用。

1.4 免疫层析胶体金试纸条的制备[15-18]

1.4.1 检测线、控制线包被浓度的确定

用包被缓冲液（PBS，配方同1.3.1节）稀释新霉素偶联抗原，设置点膜仪参数为0.1 L/mm，包被T1、T2两条不同质量浓度的新霉素偶联抗原在2.5 cm×30 cm硝酸纤维素膜上（无需封闭），作为层析试纸条的检测线；包被二抗（兔抗鼠抗体）在同一硝酸纤维素膜上作为层析试纸条的控制线，其中控制线包被在两条检测线上方，37 ℃恒温培养箱2 h，烘干备用；以抗体-胶体金复合物在胶体金结合垫上作为游离反应物，通过分析对添加新霉素标准品的检测结果，调整T1、T2两条检测线的包被质量浓度，使T1、T2在检测牛乳样品时，新霉素最终灵敏度分别为200 μg/kg和400 μg/kg。

1.4.2 胶体金试纸条各组分的组装

样品垫（预先切割成2 cm×30 cm规格的玻璃纤维），经预处理液（Na2B4O710H2O 38.130 g、PVP-10 10 g、BSA 1 g、Triton X-100溶液 10 mL，溶于1 L蒸馏水，硼酸颗粒调节pH（8.5±0.1））处理：1 000 mL样品垫预处理液倒入塑料盒中，放入200 条样品垫充分浸泡5 min，用手去掉多余的液体。将处理后的样品垫放于已洗净并烘干的筛网上，整齐平铺后放于37 ℃干燥箱中过夜干燥。

吸水垫制备用裁纸刀切割成3.8 cm×30 cm的规格备用。依次将吸水垫、包被有T1、T2线和C线的硝酸纤维素膜、胶体金结合垫和样品垫依次贴到PVC背衬上，组装成大卡，粘贴5.5 cm×30 cm Max线标签于胶体金结合垫和样品垫上将其固定；然后将大卡用斩切机切割成4 mm宽度的试纸条，用于后续实验。

1.4.3 样品检测

向不含氨基糖苷类抗生素的阴性牛乳样中添加0～500 μg/kg的新霉素标准品，检测试纸条T1、T2线的灵敏度，每个添加样品平行数为10，并对50 份未知牛乳样，分别使用试纸条和仪器方法GB/T 21323—2007 《动物组织中氨基糖苷类药物残留量的测定：高效液相色谱-质谱法/质谱法》进行检测，比对结果的一致性。

取所需数量空白酶标板微孔，置于微孔板上；向每个微孔中依次加入100 L样品稀释液（PBS）和100 L待测牛乳样，混匀，待测。从塑料筒中取出检测条，向每孔中插入试纸条，等待5 min观察结果，20 min后结果无效。结果判定：T1、T2线和C线均显色，判断为阴性；T1线不显色，T2线及C线显色，判断为高灵敏度阳性；T1、T2线均不显色，C线显色，判断为低灵敏度阳性；C线不显色，判定试纸条失效。

2 结果与分析

2.1 胶体金溶液的制备

所制备的胶体金颜色为红色，透明，用全波长酶标仪在510～550 nm波长范围内测定其最大吸收波长，其最大吸光度为1.149，对应的吸收波长为528 nm（图1）。

图 1 胶体金溶液最大吸收波长扫描图Fig.1 Maximum absorption wavelength of the colloidal gold solution

2.2 最适pH值的确定

从上述实验确定最适标记pH值为8，与大多数小分子胶体金抗体标记最适pH值相近。

2.3 最低标记蛋白量的确定

最终实验结果，确定最小蛋白用量为15 L，即3 g/mL，符合竞争法蛋白标记量较低的预期量。

2.4 免疫层析胶体金试纸条的制备

制备的半定量胶体金试纸条与传统胶体金试纸条相比，多了一条检测线，经实验检测最终结果验证，确定控制线包被质量浓度为0.3 mg/mL，两条检测线T1、T2抗原包被质量浓度分别为0.03 mg/mL和0.1 mg/mL。

2.5 样品检测

试纸条检测含有100、200、300、400 μg/kg和500 μg/kg的新霉素时，添加至100 μg/kg时，T1、T2线颜色均有变浅趋势，添加至200 μg/kg，100% T1检测线消线，添加至400 μg/kg，100% T2检测线消线，因此组装的免疫胶体金试纸条检测牛乳样品，T1、T2两条检测线的灵敏度可分别达到200 μg/kg和400 μg/kg（图2、3）。且样品仅需稀释即可上样检测，5 min之内即可出结果，方法简便，可实现现场快速检测，肉眼观察结果可维持20 min不变（图4），结果稳定。

图 2 阴性牛乳样品添加新霉素标准品200 g/kg和400 g/kg检测结果Fig.2 Results obtained from the strip for negative milk samples spiked neomycin standard at 200 g/kg and 400 g/kg

图 3 阴性牛乳样品添加新霉素标准品100～500 g/kg检测结果Fig.3 Results obtained from the strip for negative milk samples spiked with neomycin standard at concentrations of 100–500 g/kg

图 4 试剂条检测含200 g/kg和400 g/kg新霉素牛乳在5、10、15、20 min时的检测结果Fig.4 Results obtained from the strip for milk samples spiked with neomycin standard at 200 and 400 g/kg at different testing times (5, 10,15 and 20 min)

注：χ2=0；P＞0.05；符合率：100%。

对50 份盲样牛乳的检测结果，与高效液相色谱-质谱法一致，结果准确可靠（表1）。

3 讨论与结论

胶体金免疫层析技术是出现于20世纪80年代的一种独特的免疫学检测技术，其操作简单、快速、特异性好，结果清楚，易于判断和保存，且无需仪器。但由于目前只能进行定性测定，因此阻碍了这一技术的进一步应用。为此本研究就胶体金免疫层析技术进行半定量测定改进[19-20]，相对于酶联免疫吸附半定量方法来说，操作更简便，不需要酶标仪等设备，能够实现现场快速检测，使胶体金试纸条这一检测方法精确度更高，满足市场对牛乳质量检测监控的需要。

本研究所制备的免疫层析试纸条在检测牛乳样品时，检测方法简单，所需检测时间短，可实现现场快速检测，为不仅实现对样品的定性检测，更能对样品进行半定量检测，为乳制品质量控制技术提供了便捷的方法。

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