傅里叶变换近红外光谱技术测定绿茶全氮量

杨 丹，刘 新*，张颖彬，尹 鹏

（中国农业科学 院茶叶研究所，农业部茶叶质量监督检验测试中心，浙江 杭州 310008）

全氮量与绿茶品质密切相关，是重要的品质指标值[1]，绿茶中的总氮主 要包括蛋白质、游离氨基酸、生物碱、叶绿素、芳香物质中的含氮化合物等成分中的氮。绿茶中全氮量的传统测定方法以凯氏定氮法[2]为主，此测定方法存在测定时间长、过程繁琐、污染环境等缺陷。近红外光谱技术是一种绿色、快速、高效的新型定性、定量分析技术，目前在农产品[3-4]、食品工业[5-6]等领域已广泛应用，是近年来发展最快的测定技术之一，在茶叶及茶制品的理化检测、品质评价、真伪识别等方面也表现 出巨大的潜力。

日本最早开始研究近红外光谱技术在茶叶中的应用，测定绿茶中包括总氮量在内的主要化学成分[7-8]，已研制出专门的近红外分析 仪，广泛应用于茶叶的品质检测以及茶叶生产加工过程中的质量管理[9-10]。而我国有关近红外光谱技术还处于实验室研究阶段，主要集中在成品茶[11-12]、茶汤[13-15]、茶鲜叶[3,16]常规理化成分的测定和茶叶种类产地识别[17-19]等方面，关于应用现代近红外光谱（near infrared spectroscopy，NIR）技术检测绿茶中全氮量的研究报道甚少，与日本相比，我国茶叶因茶树品种、种植地域、加工工艺的不同，绿茶种类繁多，有必要研制出适用于我国茶叶品质检测的实用模型。

本实验将开展利用傅里叶变换近红外光谱（fourier transform near infrared spectroscopy，FT-NIR）技术检测绿茶全氮量的研究，以期建立稳定性好、精确度高的绿茶全氮量近红外分析模型。全氮量与绿茶嫩度密切相关，鲜叶原料品质的优劣，主要与鲜叶嫩度相关。绿茶的嫩度等级从单芽、一芽一叶、一芽二叶直到较粗老产品，全氮量的变化趋势明显且较易分类，为了进一步提高绿茶全氮量近红外定量分析模型的预测准确度，对绿茶样品进行评审分类，建立绿茶全氮量不同嫩度等级的子模型。希望通过本实验的研究，能推进近红外光谱技术在茶叶成分检测中的应用推广，提高茶叶产品相应的品质检测水平。

1 材料与方法

1.1 材料及制备

选用2011—2012年的具有代表性的绿茶样品425 个，每年分多次取样且所有样品各不相同，不断的增加模型中的样本数量。为了更好的增加稳定性，每个样品均在同一天测定化学值并采集光谱图。样品覆盖全国主要 产茶区，包含茶树品种不同（中小叶种、大叶种）、老嫩度差异明显，加工工艺不同（炒青、烘青、蒸青等）的样品。每份样品取30 g左右，选用0.5 mm的筛网，粉碎离心过筛，得到粒度均匀的粉碎样。

1.2 仪器与设备

AntarisⅡ傅里叶近红外光谱分析仪 美国Thermo Fisher Scientific公司；KJELTEC2300全自动定氮仪 瑞典Foss Tecator公司；ZM200超离心研磨机（0.5 mm的筛网） 德国Retsch公司。

1.3 方法

1.3.1 全氮量的测定

采用凯氏定氮法，称取0.5 g绿茶粉碎样于消化管，加入浓硫酸与催化剂消解，用全自动定氮仪测定每份样品全氮量，同时测定茶样的干物质率，将全氮量以干态质量分数表示。取3 次平行测定的平均值 为每个样品的实际测定值。

1.3.2 光谱采集

采用傅里叶近红外光谱分析仪扫描粉碎过筛的样品，每个样品重复装样3 次，装样量（20、10 mL小烧杯）、样品松紧度（金属图章压实）， 扫描次数64 次，分辨率4 cm－1，光谱采集范围3 800～12 000 cm－1，旋转装样皿，每个样品扫描前均采集背景光谱。

1.3.3 绿茶全氮量校正模型的建立与外部验证

考虑到样品量较大，根据全氮量含量大小排序，平均隔n 个样品选择1 个样品的方式来选择验证集的方法较为繁琐，且前期实验的预测结果比较也与TQ软件自动选择的相当。本实验利用TQ软件自动选择325 个样品作校正集，全谱波段下采用偏最小二乘（partial least square，PLS）回归法建立校正模型。对光谱进行预处理：多元散射校正（multiplicative signal correction，MSC）、标准正态变量变换（standard normal variate，SNV）、一阶导数（first derivative，FD）、卷积平滑法（savitzky-golay filter，SG）、Norris导数滤波（norris derivative，ND）。比较对校正模型的影响；选择波段区间：考虑全谱区、避开仪器噪声信号、水分、水蒸气吸收波数区间、选择氮的特征吸收波段区间；对校正模型进行内部交叉验证。

选择余下100 个样品作外部验证集，验证模型的预测性能。所有数据处理均在仪器自带的TQ Analyst软件中进行，以校正集样品的均方差（RMSEC）、交叉验证均方差（RMSECV）、相关系数、因子数为指标来优化模型，以验证集样品的预测均方差（RMSEP）、相关系数和性能指数考察模型的预测准确度。

1.3.4 绿茶样品的嫩度分级与子模型的建立

根据GB/T 23776—2009《茶叶感官审评方法》，对425 个绿茶样品进行感官审评，并根据老嫩度的明显差异进行分级：从单芽、一芽一叶、一芽二叶以及较粗老的精制茶等，共6 个等级。

将绿茶样品根据嫩度等级在全谱波段下采用PLS建立绿茶全氮量的子模型，不进行光谱预处理。按全氮量排序，隔n选1的方式，每个嫩度等级分别选出6 个验证集样品，余下的为校正集样品。将各嫩度等级的校正集样品合并，建立全氮量总校正模型。各子模型和总模型预测验证集样品全 氮量，评价子模型预测性能。

2 结果与分析

2.1 绿茶全氮量的实测值

随着绿茶嫩度的增加，全氮含量越高，结果见表1。特级到2级都属于较嫩的茶，从单芽到一芽二叶，多为名优绿茶。嫩度等级被评为3级的样品以大宗型绿茶居多，炒青较多。嫩度等级被评为4级和5级的样品的全氮量均值为4.48%、3.89%，属于比较粗老的绿茶，如珠茶、眉茶等。

表 1 绿茶全氮量实测值Table 1 Measured values of total nitrogen content in green tea

2.2 绿茶近红外平均光谱图

从图1可知，波段区间3 900～5 100 cm－1范围内近红外透光率大，信息量丰富。12 000～10 200、3 900～3 800 cm－1处仪器产生的噪声信号较大；在5 100～5 600 cm－1，6 900～7 400 cm－1之间仍会受水蒸气的影响产生了较小的噪声信号。因 此在模型建立时需要考虑是否有必要避开这些波数区间。氮的NIR吸收主要与N—H的分子振动相关。有学者研究表明：N—H键伸缩振动的一级倍频在6 666 cm－1附近，伸缩振动与弯曲振动的组合频在5 000 cm－1附近，带有N—H的杂环芳香化合物，较强的一级倍频出现在6 835 cm－1，组合频出现在4 715 cm－1附近[20]。而蛋白质的特征谱带为10 277～9 804 cm－1、6 667～6 536 cm－1的N—H倍频吸收，以及4 878～4 854 cm－1的N—H组合频吸收，4 613～4 587 cm－1的N—H与C=O/N—H /C—N组合频[21]。因此在模型建立时需要考虑特征波数区间的选取。

图 1 绿茶近红外平均光谱图Fig.1 Average near-infrared spectrogram s of green tea

2.3 波段选择与光谱预处理对绿茶全氮量模型的影响

采用PLS回归法建立模型，采用TQ软件中的Spectrum Outlier diagnostic排除偏差较大的9 个异常值，最终确定选择316 个样品作校正集，在全谱波段3 814～12 000 cm－1范围内建立的绿茶全氮量的PLS校正模型。各波段区间的模型在最佳光谱预处理下的预测结果如表2所示。

表 2 波段区间与光谱预处理选取对全氮量模型预测性能的影响Table 2 Model statistical parameters for total nitrogen content under different wavebands and spectral pretreatments

以R M S E P为评价指标，从表2可以看出，在4 691～3 959、5 126～4 848 cm－1（序号6）两波段区间内的模型预测性能最好，此区间内包含了主要的N—H键、N—H与C—N键、N—H与C=O键的特征吸收波数，且避开了模型的水分与噪声干扰，光谱经过一阶导数与SG平滑处理后，验证集样品的预测值与实测值的RMSEP为0.092 5%。此外，与在全谱区（序号1）建立的模型相比，当波段区间避开水分、水蒸气吸收、仪器噪声后，模型的预测结果略好，RMSEP由原来的0.098 0%降到0.093 8%（序号2）和0.093 1%（序号8），因子载荷图也降低了一维。实验结果证明，在建模之前根据组分吸收近红外的信息对波数区间进行选择，是一种有效的优化模型方法，有助于减少噪音信号的影响、提高运算速率和模型的稳定性。

2.4 绿茶全氮量校正模型的建立与外部验证

图 2 绿茶全氮量的校正模型与外部验证结果Fig.2 Calibration model of total nitrogen content in green tea and external verification results

采用优选后的波段区间和一阶导数与SG平滑处理，建立了绿茶全氮量的偏最小二乘模型，校正模型的因子载荷图见图2b，在建模因子为9时，RESECV值趋于平缓，已降到最低值，因此选择9个因子建立校正模型。模型因子数为9时，316 个校正集的绿茶样品全氮量的实测值与预测值见图2a；所有校正集样品的绿茶全氮量的实测值与预测值的校正均方差（RMSEC）为0.088 4%，预测误差在0.001 1%～0.325 9%之间（图2d），平均预测误差0.069 2%，相关系数为0.994 8。为了更好的评价模型的预测性能，选择100个样品作外部验证集；用已建立的校正模型对其进行预测，预测结果如图2c所示：验证集样品的全氮量的预测值与实测值的RMSEP为0.092 5%，预测误差在0.191 2%～0.0001%之间（图2d），平均预测误差0.079 3%，相关系数为0.993 9，绿茶全氮量模型的预测结果很好。

将100 个验证集样品全氮量的实测值与模型预测值采用SAS软件进行T检验分析，标准偏差为0.009 9，在0.05显著性水平下，T值为－0.18，P值为0.859 8，2 种测定方法无显著性差别，可以应用傅里叶近红外光谱技术快速测定绿茶全氮量。

2.5 绿茶全氮量子模型的建立与外部验证

表 3 全氮量子模型统计参数Table 3 Statistic parameters of sub-models for total nitrogen content

从表3可以看出，绿茶样品根据嫩度等级分类后，建立的各子模型的校正集样品的RMSEC均有不同程度的降低。与嫩度总模型的预测性能相比，特级、1、3、5级的RMSEP值均值低于总模型。其中3、5级子模型的相关系数均在0.99以上。在校正模型的建立与应用中，根据嫩度等级来建立子模型，可以提高模型的预测性能。3级子模型的对3级验证集样品的预测结果最好，样品的全氮量的预测值与实测值的RMSEP值最小，为0.037 9，相关系数为0.996 1。

各子模型对验证样品的预测值与实测值的比较，见表4。嫩度等级评为特级、1、5级的验证集样品的子模型预测结果（平均偏差分别为0.007%、0.018%、0.026%）均优于总模型的预测结果（平均偏差分别为0.057%、0.041%、0.097%），其中特级样品采用特级子模型预测全氮量时，验证样品的预测值与实测值的平均偏差最小，为0.007%，预测值最接近实测值，而采用中小叶种和总模型预测时，其平均偏差相对较大，分别为0.049%、0.057%。3级验证集样品用总模型和3级子模型预测时，其平均偏差都很小，分别为0.015%、0.018%，预测值接近实测值；因此，对于嫩度较好的样品，采用嫩度相应的子模型对其进行预测，可以提高其预测性能。对于粗老的5级样品，采用5级子模型进行预测，预测结果更好。对于嫩度一般的3级样品，由于总模型中3级样品总量最多，是其他样品的2～3 倍，因此进行预测时，采用子模型与总模型的预测结果相当。这也说明了校正集代表性样品数量的重要性。

表 4 验证集样品的实测值与预测值Table 4 Actual measured and calculated values of the validation set%

3 结 论

传统的凯氏定氮法，不仅费时，还需大量试剂，本实验采用偏最小二乘法，结合傅里叶变换近红外光谱仪，建立了近红外光谱技术测定绿茶含氮的定量分析模型，模型能满足绿茶全氮量的快速检测要求。验证集样品的RMSEP为0.092 5，相关系数分别为0.993 9。此外，绿茶种类繁多，嫩度不一，实验根据嫩度等级，建立了绿茶全氮量子模型，提高了模型的预测性能。与总模型的预测性能相比，特级、1级、3级、5级的RMSEP值均低于总模型。嫩度为3级的子模型预测结果最好，样品的全氮量的预测值与实测值的RMSEP值最小，为0.037 9，相关系数为0.996 1。每年可继续添加新样品来优化模型，提高模型的实际检测性能，进一步推广近红外 光谱技术在茶叶品质快速检测领域的应用。

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