应用DPO-PCR技术检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7

徐义刚，李丹丹，崔丽春，刘忠梅，李苏龙

（1.黑龙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心，黑龙江 哈尔滨 150001；2.海南出入境检验检疫局检验检疫技术中心，海南 海口 570125；3.东北林业大学研究生院，黑龙江 哈尔滨 150040）

肠出血性大肠杆菌（enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC）是大肠杆菌的一个亚型，主要致病菌株血清型为O157∶H7，呈全球性分布，可产生志贺氏毒素样细胞毒素[1-2]。畜禽为本病储存宿主和主要传染源，如牛、羊、猪等，以牛带菌率最高。EHEC O157∶H7传播途径复杂多样，主要通过进食被污染的食物、水或与病人接触而传染，出现腹泻、出血性结肠炎、溶血性贫血和溶血性尿毒综合征等临床症状[3-6]。常见被污染的食物有牛肉、牛奶及其制品、禽肉、羊肉、蔬菜和水果等，快餐类食品极易造成暴发性食物中毒。EHEC O157∶H7引起的危害受到广泛关注，建立快速、准确的检测方法对防控该致病菌具有重要意义。

传统的检测方法（分离培养结合生化与血清学鉴定）检测时间长、敏感性差、严重影响检测效率[7-8]。为满足EHEC O157∶H7快速检测要求，研发出了免疫磁珠富集法[9]、生物传感器法[10-12]、蛋白芯片[13]、基因芯片[14]、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）[15-20]、实时荧光PCR[21-23]和LAMP[24]等检测方法。其中，PCR方法因检测快速、灵敏度高，成为主要采用的检测方法。引物设计是建立有效PCR方法的关键因素，常规的PCR引物设计，不仅需要反复优化引物的各项参数与反应条件，尤其是退火温度，而且需要反复比对引物的特异性，以防止非特异性扩增，尤其是涉及多重PCR方法设计时，需要大量的实验以验证方法的特异性，费时又费力。

双启动寡核苷酸引物（dual-priming oligonucleotide，DPO）是一种新型的引物设计方法：DPO引物分为2个部分，即长5’-端（18～25 bp，Tm＞65 ℃）和短3’-端（6～12 bp，GC含量为40%～80%），两者间用多聚次黄嘌呤连接；基于DPO引物的特殊结构，引物自身以及引物间难形成二级结构且对退火温度不敏感，实验过程中不需要对引物进行筛选以及对退火温度进行优化，简化了引物设计和实验步骤；扩增时，只要DPO引物5’-端或3’-端有3 个以上碱基发生错配，PCR扩增就会终止，有效地阻断了非特异性扩增，特异性更强[25-28]。本研究利用该技术，建立了EHEC O157∶H7基于DPO引物的PCR检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

本研究所用实验菌株有：肠出血性大肠杆菌O157∶H7 ATCC 35150、产肠毒素大肠杆菌ATCC 35401、肠侵袭性大肠杆菌ATCC 43893、肠致病性大肠杆菌ATCC 43887、大肠杆菌ATCC 25922、阪崎肠杆菌ATCC 51329、单核细胞增生李斯特氏菌ATCC 19111、嗜水气单胞菌ATCC 7966、空肠弯曲菌ATCC 33560、变形杆菌ATCC 49027、沙门氏菌ATCC 10708、志贺氏菌ATCC 12022、金黄色葡萄球菌ATCC 29213、小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC 9610、粘质沙雷菌ATCC 14756、肺炎克雷伯氏菌ATCC 10031、霍乱弧菌ATCC 14035、副溶血弧菌ATCC 27519、溶藻弧菌ATCC 33839和创伤弧菌ATCC 33149 美国典型菌种保藏中心（ATCC）；溶血性链球菌CMCC 32121 中国医学微生物菌种保藏中心（CMCC）；肠出血性大肠杆菌O157∶H7分离株2 株、拟态弧菌分离株1 株和大肠杆菌分离株2 株由本实验室分离保存。

1.1.2 试剂

细菌基因组DNA提取试剂盒 北京天根生化科技有限公司；Taq DNA Polymerase、dNTP、MgCl2日本TaKaRa公司；复合增菌培养基BPW 北京兰伯瑞生物技术公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计

以肠出血性大肠杆菌O157∶H7 rfbE基因为靶基因，经BLAST分析，选取rfbE基因保守区域设计DPO引物，详见表1，引物由上海生工生物工程公司合成。

表 1 引物序列Table 1 Primers used in this study

1.2.2 细菌DNA提取

将1.1.1节中的菌株分别接种于5 mL BPW培养基中，培养过夜，取1 mL菌液，利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA，－20 ℃保存备用。

1.2.3 DPO-PCR反应体系优化

反应体系为25 L：10×PCR Buffer（Mg2+free）2.5 L；Mg2+（25 mmol/L）用量范围为0.5～5.0 L，以0.5 L递增；dNTP（2.5 mmol/L for each）用量范围为0.25～2.5 L，以0.25 L递增；Taq DNA Polymerase （5 U/ L）用量范围为0.05～0.5 L，以0.05 L递增；DPO引物（上、下游各10 mol/L）用量范围为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0 L；细菌DNA 模板1 L，去离子水补充至25 L。反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，57.5 ℃ 45 s，72 ℃45 s，30 个循环；72 ℃终延伸10 min。经琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。

1.2.4 DPO-PCR退火温度不敏感性实验

将退火温度范围设为45～65 ℃，进行DPO-PCR反应，经琼脂糖凝胶电泳检测其扩增效果，并与常规PCR引物进行比较。

1.2.5 DPO-PCR灵敏度实验

将菌体浓度约为9.4×106CFU/mL的EHEC O157∶H7进行10倍梯度稀释，提取每级稀释度EHEC O157∶H7的基因组DNA，以此为模板进行DPO-PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测确定检测灵敏度。

1.2.6 DPO-PCR特异性实验

利用建立的DPO-PCR方法检测1.1.1节所示菌株以及小鼠、鸡、鹅和猪肠道细菌（经检测不含EHEC O157∶H7）宏基因组，以验证本方法的特异性，并与常规PCR引物进行比较。

1.2.7 方法验证实验

将建立的EHEC O157∶H7 DPO-PCR检测方法应用于检验检疫实践工作中，以检验检疫行业标准（SN/T 0973—2010《进出口肉、肉制品及其他食品中肠出血性大肠杆菌O157∶H7检测方法》）检测结果作为参照，验证其可靠性。

2 结果与分析

2.1 EHEC O157∶H7 DPO-PCR检测方法的建立

以EHEC O157∶H7 rfbE基因为靶基因，设计一对DPO引物，经反应体系的优化，建立了EHEC O157∶H7 DPOPCR检测方法，优化后的反应体系为（25 L）：10×PCR Buffer（Mg2+free）2.5 L，Taq DNA Polymerase（5 U/ L）0.1 L（图1A中2泳道），Mg2+（25 mmol/L）2.5 L（图1B中5泳道），dNTP（2.5 mmol/L）1.5 L（图1C中6泳道），上、下游DPO引物（10 mol/L）各0.5 L（图1D中5泳道），DNA模板1 L，去离子水补充至25 L。

图 1 EHEC O15577∶H7 DPO-PCR检测方法的建立Fig.1 Development of DPO-PCR method for the detection of EHEC O157∶H7

2.2 DPO-PCR退火温度不敏感性

退火温度设为45～65 ℃时，利用DPO引物进行PCR扩增，扩增效率随着退火温度的变化基本保持一致，而利用常规引物进行PCR扩增时，扩增效率随着退火温度的升高逐渐增加后下降（图2），表明DPO引物的退火温度范围较宽。

图 2 DPO引物退火温度不敏感性Fig.2 Insensitivity of DPO primers to annealing temperature

2.3 DPO-PCR检测灵敏度

将菌体浓度为9.4×106CFU/mL的EHEC O157∶H7经105倍稀释后，利用建立的DPO-PCR方法仍能有效扩增出目的基因片段（图3），显示该DPO-PCR方法检测EHEC O157∶H7的灵敏度为94 CFU/mL。

M. DNA marker 2000；1. 9.4×106 CFU/mL；2. 9.4×105 CFU/mL;3. 9.4×104 CFU/mL；4. 9.4×103 CFU/mL；5. 9.4×102 CFU/mL；6. 9.4×101 CFU/mL；7. 9.4×100 CFU/mL。

2.4 DPO-PCR检测特异性

利用建立的DPO-PCR方法检测1.1.1节所示细菌以及小鼠、鸡、鹅和猪肠道细菌宏基因组，结果显示：EHEC O157∶H7菌株 （ATCC 35150和2 株分离株）均为DPO-PCR阳性结果，其他为阴性结果，且未见非特异性扩增条带出现，而利用常规PCR引物扩增出现了与目的基因片段大小相近的非特异性条带（图4），表明本研究建立的EHEC O157∶H7 DPO-PCR检测方法较常规PCR特异性更强。

图 4 EHEC O15577∶H7 DPO-PCR检测方法特异性结果Fig.4 Specificity of DPO-PCR method for EHEC O157∶H7

2.5 方法实践验证

利用建立的EHEC O157∶H7 DPO-PCR检测方法对228份采集的样本进行了检测，共检测出4份EHEC O157∶H7阳性样本，经检验检疫行业标准法（SN/T 0973—2010）复检，两者检测结果一致，见表2，显示该方法具有良好的实用性。

表 2 方法实践应用Table 2 Detection of EHEC O157 H7 in real samples by the DPO-PCR method

3 结 论

DPO引物与常规PCR引物相比，设计简易，不需要对引物参数进行反复优化，在45～65 ℃的退火温度范围内，DPO引物均能保持高效率扩增。此外，DPO引物中的次黄嘌呤碱基的氢键结合力弱，在DPO引物引导PCR扩增时，如果5'-端或3'-端存在3 个以上碱基错配，DPO引物便会与DNA模板发生脱离，终止PCR反应，有效地阻断非特异性扩增，增加了检测特异性，而且DPO引物自身以及引物间难形成二级结构，提高了扩增效率。实践应用证明，本研究建立的EHEC O157∶H7 DPO-PCR检测方法检测快速、结果准确，具有良好的实用性。

[1]RILEY L W, REMIS R S, HELGERSON S D, et al. Hemorrhagic colitis associated with a rare Escherichia coli serotype[J]. New England Journal of Medicine, 1983, 308(12): 681-685.

[2]ORSKOV F, ORSKOV I. Escherichia coli serotyping and disease in man and animals[J]. Canada Journal of Microbiology, 1992, 38(7):699-704.

[3]BOLTON F J, CROZIER L, WILLAMSON L K. Isolation of Escherichia coli O157 from raw product[J]. Letters in Applied Microbiology, 1996, 23(5): 317-321.

[4]PHILLIPS C A. The epidemiology detection and control of Escherichia coli O157[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 1999, 79(11): 1367-1381.

[5]王燕, 谢贵林, 杜琳. 大肠杆菌O157:H7感染流行概况[J]. 微生物学免疫学进展, 2008, 36(1): 51-58.

[6]CALL D R, BORUCKI M K, LOGE F J. Detection of bacterial pathogens in environmental samples using DNA microarrays[J].Journal of Microbiological Methods, 2003, 53(2): 235-243.

[7]宋宏新, 李宏. 肠出血性大肠杆菌O157:H7的检测方法进展[J]. 食品科学, 2007, 28(11): 607-610.

[8]陈苏红, 孙国祥, 王升启. 大肠杆菌O157:H7实验室诊断方法研究进展[J]. 浙江预防医学, 2005, 17(12): 52-54.

[9]俞顺章, 卢林耿, 张幼展, 等. 快速检测大肠杆菌O157菌株在流行病学上的应用[J]. 中华流行病学杂志, 1999, 20(4): 237-239.

[10]DEMARCO D R, LIM D V. Detection of Escherichia coli O157:H7 in 10 and 25-gramground beef samples with an evanescent-wave biosensor with silica and polystyrene waveguides[J]. Journal of Food Protection, 2002, 65(4): 596-602.

[11]李杜娟, 王剑平, 盖玲, 等. 快速检测大肠杆菌O157:H7的电化学阻抗免疫生物传感器[J]. 传感技术学报, 2008, 21(5): 709-714.

[12]斯城燕, 叶尊忠, 王一娴, 等. SPR生物传感器快速检测大肠杆菌O157∶H7的研究[J]. 光谱学与光谱分析, 2011, 31(10): 2598-2601.

[13]LEE W, PARK K S, KIM Y W, et al. Protein array consisting of solgel bioactive platform for detection of E. coli O157:H7[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2005, 20(11): 2292-2299.

[14]CALL D R, BROCKMAN F J, CHANDLER D P. Detecting and genotyping Escherichia coli O157:H7 using multiplexed PCR and nucleic acid microarrays[J]. International Journal of Food Microbiology, 2001, 67(1/2): 71-80.

[15]刘金华, 王蓓蕾, 马路遥, 等. 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157、普通变形杆菌和副溶血弧菌多重PCR检测体系的构建[J]. 中国免疫学杂志, 2012, 28(12): 1120-1124.

[16]曲泽慧, 陈佩佩, 张爱芹, 等. 产肠毒素大肠杆菌双重PCR检测方法的建立[J]. 中国畜牧兽医, 2013, 40(7): 65-68.

[17]FACH P, PERELLE S, GROUT J, et a1. Comparison of different PCR teats for detecting Shigatoxin-Producing Escherichia coli O157 and development of an ELISA-PCR assay for specific identification of the bacteria[J]. Journal of Microbiological Methods, 2003, 55(2): 389-392.

[18]SCOTTER S, ALDRIDGE M. Validation of a method for the detection of E.coli O157:H7 in foods[J]. Food Control, 2000, 11(2): 85-95.

[19]巢强国, 杨学明, 葛宇, 等. PCR法检测食品中大肠杆菌O157:H7[J].食品科学, 2010, 31(8): 212-215.

[20]徐晓可, 吴清平, 周艳红, 等. 肉类中大肠杆菌O157:H7多重PCR检测方法的建立[J]. 微生物学通报, 2008, 35(4): 619-622.

[21]胡慧, 陈雅君, 段志刚, 等. 大肠杆菌O157:H7 特异基因的实时荧光定量PCR检测[J]. 食品科学, 2011, 32(12): 278-282.

[22]陈思, 黄昆仑, 许文涛, 等. 实时荧光定量PCR 方法检测大肠杆菌O157:H7[J]. 农业生物技术学报, 2006, 14(5): 779-782.

[23]王力均, 许恒毅, 熊勇华, 等. 荧光定量PCR在大肠杆菌O157:H7检测中的应用研究进展[J]. 食品科学, 2013, 34(11): 358-362.

[24]徐义刚, 崔丽春, 李苏龙, 等. 肠出血性大肠埃希菌O157: H7环介导恒温扩增快速检测方法的建立与应用[J]. 中国人兽共患病学报,2010, 26(7): 618-623.

[25]CHUN J Y, KIM K J, HWANG I T, et al. Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene[J]. Nucleic Acids Research, 2007, 35(6): e40.

[26]刘梅, 黄新, 马占鸿, 等. 应用DPO引物检测马铃薯病毒的多重RTPCR技术研究[J]. 植物病理学报, 2009, 39(4): 431-434.

[27]徐焕洲, 平芮巾, 季汝武, 等. 应用DPO 引物技术同时检测5 种蚊媒病毒的多重RT-PCR方法[J]. 中国国境卫生检疫杂志, 2012, 35(2):73-75.

[28]WOO H Y, PARK H, KIM B I, et al. Evaluation of dual priming oligonucleotide (DPO)-based multiplex PCR for detection of HBV YMDD mutants[J]. Archives of Virology, 2008, 153(11):2019-2025.