同位素稀释-超高效液相色谱-串联质谱法测定鱼肉中8 种全氟化合物

贺小敏，陈 浩*

（1.华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 430070；2.湖北省环境监测中心站，湖北 武汉 430072；3.华中农业大学理学院，湖北 武汉 430070）

全氟化合物（perfluorinated compounds，PFCs）是化合物分子中与碳原子连接的氢原子完全被氟原子取代的一类有机化合物，具有独特的疏水、疏油特性，其分子结构中含有极高键能的碳氟键，因而其化学稳定性高、生物惰性强，在环境中难以光解、水解及生物降解。早在20世纪50年代，PFCs就广泛应用于表面处理、纸张保护、工业清洗剂、防火泡沫、地板抛光剂等民用及工业领域[1]。PFCs能够诱发肝中毒，具有发育毒性、免疫毒性、内分泌干扰等生物毒性[2]。在2009年5月召开的《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》第四次缔约方大会上，全氟辛基磺酸及其盐和全氟辛基磺酰氟被正式列入持久性有机污染物名单附件B加以限制。大量的研究证明，PFCs能通过各种途径进入土壤、水体、大气等环境介质中，并通过食物链传递放大[3]。PFCs在各类环境介质、生物体和人体中均能检出，并且存在于全球各个地方甚至南北极地区[1,4-5]，因而PFCs 造成的污染引起了人们的广泛关注。

PFCs的检测方法有气相色谱（gas chromatography，GC）法[6]、气相色谱质谱（gas chromatography- mass chromatography，GC-MS）法[7]、液相色谱-荧光探测器法[8]、离子排斥色谱法[9]、液相色谱质谱（liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）法[10]和液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS-MS）法[11-13]。其中GC、GC-MS和HPLC-荧光探测器法在分析前需要对PFCs衍生化，其处理过程复杂；离子排斥色谱法仅适用于分析短链PFCs；HPLC-MS中单四极杆质谱在分析复杂样品时灵敏度低、抗干扰能力弱，离子阱质谱适用于PFCs同分异构体的定性和结构解析，对于痕量PFCs灵敏度较低；HPLC-MS-MS中，四极杆-飞行时间质谱仪具有很高的分辨率，能够对环境中大多数PFCs进行定性，但与三重四极杆质谱仪相比，其灵敏度较低，线性范围较窄；HPLC-MS-MS特别是高效液相色谱-负电喷雾-三重四极杆串联质谱法在分析复杂样品中PFCs含量时，选择性和灵敏度高、检出限低[14]，能简化复杂基质的前处理过程，在痕量的PFCs检测分析中具有显著的优势。

鱼是人类重要的膳食成分，建立鱼肉中PFCs的分析方法对于人类健康具有重要意义。目前，鱼体中PFCs的分析方法已有一些研究，多采用碱液消解或混合无机酸消解-固相萃取-HPLC-MS-MS法[11-13]。这些方法前处理步骤复杂，且大多采用外标法或个别同位素作为内标的多种PFCs同时测定方法，由于外标法易受环境及仪器条件的变化而影响测定准确度，以个别同位素作为内标的方法又难以较好补偿样品预处理及检测过程中的诸多因素对其他PFCs检测结果的影响。同位素稀释法是在试样处理前加入待测化合物的同位素，利用同位素比值的变化来定量测定待测化合物浓度的方法。随着该技术的发展，应用同位素稀释技术进行质谱确认，能够准确地定性和定量，弥补了外标法或一般内标法的不足，提高了分析结果的准确性和可靠性。本实验在前人研究的基础上，利用同位素稀释技术，采用乙腈超声萃取鱼肉中8 种PFCs，经弱阴离子固相萃取柱净化分离，由UPLC-MSMS分析检测。该方法简化了前处理步骤，具有净化效果好、定量准确、灵敏度高的特点，扩大了鱼样中PFCs的分析方法，用于实际鱼肉中PFCs的分析测定，获得了满意的结果。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鱼肉，来自湖北丹江口水库鱼样，取肌肉组织冷冻干燥。

全氟丁酸（perfluoro-n-butanoic acid，PFBA，CAS 375-22-4）、全氟己酸（perfluoro-n-hexanoic acid，PFHxA，CAS 307-24-4）、全氟辛酸（perfluoro-noctanoic acid，PFOA，CAS 335-67-1）、全氟壬酸（perfluoro-n-nonanoic acid，PFNA，CAS 4149-60-4）、全氟癸酸（perfluoro-n-decanoic acid，PFDA，CAS 335-76-2）、全氟十一烷基酸（perfluoro-n-undecanoic acid，PFUnDA，CAS 2058-94-8）、全氟十二烷基酸（perfluoro-n-dodecanoic acid，PFDoDA，CAS 307-55-1）、全氟辛烷磺酸（perfluorooctane sulfonate，PFOS，CAS 1763-23-1）标准溶液，质量浓度均为50 μg/mL，PFCs同位素标准混合溶液（MPFAC-MXA，包含perfluoro-n-[1,2,3,4-13C4]butanoic acid (MPFBA)、perfluoro-n-[1,2-13C2]hexanoic acid (MPFHxA)、perfluoron-[1,2,3,4-13C4]octanoic acid (MPFOA)、perfluoro-n-[1,2,3,4,5-13C5]nonanoic acid (MPFNA)、perfluoro-n-[1,2-13C2]decanoic acid (MPFDA)、sodium perfluoro-1-[1,2,3,4-13C4]octanesulfonate (MPFOS)、perfluoro-n-[1,2-13C2]undecanoic acid (MPFUnDA)、perfluoro-n-[1,2-13C2]dodecanoic acid (MPFDoDA)，质量浓度为2 μg/mL，以上标准溶液均购自加拿大威灵顿实验室；乙腈（HPLC级）、甲醇（HPLC级） 韩国Duksan公司；乙酸（HPLC级） 美国Tedia公司；乙酸铵（HPLC级）、氨水（25%，HPLC级） 美国Anaour公司；屈臣氏蒸馏水；活性炭（100目） 美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

1290 UPLC-6460 QQQ MSD超高效液相色谱-串联质谱仪、1 mL聚丙烯样品瓶 美国Agilent公司；冷冻干燥机 德国Christ公司；高速多功能粉碎机 永康市速锋工贸有限公司；visiprep 24TM DL固相萃取装置美国Supelco公司；Oasis WAX 6 mL/150 mg弱阴离子固相小柱 美国Waters公司；TURBOVAP Ⅱ氮吹仪 美国Biotage公司；H2100R高速冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；KQ-600DV超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；25、100、1 000 μL精密移液器德国Brand公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

PFCs标准储备液的配制：分别移取20 μL PFBA、PFHxA、PFOA、PFNA、PFDA、PFUnDA、PFDoDA和PFOS标准溶液（质量浓度均为50 μg/mL）置1 mL聚丙烯小瓶中，用840 μL甲醇稀释定容至1 mL，混匀后得到1 μg/mL PFCs标准储备液。

PFCs标准中间液的配制：吸取10 μL质量浓度为1 μg/mL PFCs标准储备液置1 mL聚丙烯小瓶中，用990 μL甲醇稀释定容至1 mL，混匀后得到10 μg/L PFCs标准中间液。

PFCs同位素标准中间液的配制：吸取100 μL质量浓度为2 μg/mL MPFAC-MXA标准溶液至1 mL聚丙烯小瓶中，用990 μL甲醇稀释定容至1 mL，混匀后得到200 μg/L PFCs同位素标准中间液。

PFCs标准系列溶液的配制：分别移取10、20、50、100 μL和200 μL质量浓度为10 μg/L PFCs标准中间液至1 mL聚丙烯小瓶中（先加入500 μL纯水和50 μL质量浓度为200 μg/L同位素标准中间液），再分别加入440、430、400、350 μL和250 μL甲醇稀释定容至1 mL，混匀后得到0.1、0.2、0.5、1.0 μg/L和2.0 μg/L标准系列溶液（其中同位素内标质量浓度为10 μg/L）；再分别移取5、10、20 μL和50 μL质量浓度为1 μg/mL PFCs标准溶液置1 mL聚丙烯小瓶中（先加入500 μL纯水和50 μL 质量浓度为200 μg/L PFCs同位素标准中间液），再分别加入445、440、430 μL和400 μL甲醇稀释定容至1 mL，混匀后得到5.0、10.0、20.0 μg/L和50.0 μg/L PFCs标准系列溶液（其中同位素内标质量浓度为10 μg/L）。

1.3.2 样品前处理

将新鲜鱼样用水洗净后，解剖，取出肌肉组织经冷冻干燥后，研磨成细碎粉状，混匀后转入样品瓶冷冻保存，以备分析用。准确称取1.00 g冷冻干燥后的鱼肉样品放入100 mL聚丙烯离心管中，加入40 mL乙腈和5 μL质量浓度为2 μg/mL MPFAC-MXA标准溶液。将样品加盖并超声萃取30 min，取出样品以3 500 r/min转速离心10 min，将上清液转入50 mL 聚丙烯离心管；向装有样品的离心管中再加入30 mL乙腈，超声萃取30 min，重复上述步骤合并两次上清液，氮吹浓缩至10 mL，加入40 mL纯水，得到萃取液的乙腈溶液。

利用大容量采样器将样品及预淋洗过的固相萃取小柱（使用前，依次用4 mL 0.5%氨水甲醇溶液、4 mL甲醇和4 mL水预活化）串联，开通真空泵，调节流速3～5 mL/min，使萃取液的乙腈溶液通过固相萃取柱，待样品完全流出后，用5 mL高纯水和5 mL醋酸盐缓冲溶液（pH 4）依次清洗固相萃取柱，弃去全部流出液。将固相萃取柱用5 mL甲醇清洗，再加入8 mL 0.5%氨水甲醇溶液淋洗得到目标物，收集洗脱液于10 mL聚丙烯离心管中，40℃氮吹浓缩至0.5 mL以下，加入500 L水后用甲醇定容至1 mL，将溶液（若混浊，需用适量活性炭去除杂质）过0.22 m滤膜后，用UPLC-MS-MS分析测定。

1.3.3 色谱与质谱条件

色谱条件：ZORBAX Eclipse plus C18色谱柱（100 mm×3.0 mm，3.5 m）；柱温30 ℃；流速0.3 mL/min；进样量10 L；以10 mmol乙酸铵溶液（A）和乙腈（B）进行梯度洗脱，0～1 min，70% A＋30%B；1～12 min，70% A＋30% B→10% A＋90% B；12～13 min，10% A＋90% B→ 70% A＋30% B。

质谱条件：采用电喷雾离子源，负离子模式；多反应监测方式；雾化器压力：276 kPa；干燥气流速8 L/min；干燥气温度350 ℃；毛细管电压4 000 V；定性离子对、定量离子对、电离能量和碰撞能见表1。

表 1 质谱检测条件Table 1 Mass spectrometry conditions

2 结果与分析

2.1 色谱条件的选择

PFCs同时具有疏水和疏油性质，并具有一定的表面活性和极性，因此采用较低硅羟基活性填料的C18反相柱可以实现这类化合物的分离。本研究选择同填料（ZORBAX Eclipse plus C18）但不同粒径的色谱柱A（50 mm×2.1 mm，1.8 m）和色谱柱B（100 mm×3.0 mm，3.5 m）进行分离比较，当采用乙腈和10 mmol/L醋酸铵溶液作为流动相进行梯度洗脱时，色谱柱A在5 min内能实现8 种PFCs的良好分离，并且得到了满意的分辨率和灵敏度。但该色谱柱填料粒径（1.8 m）太细，实际分析过程中容易造成色谱柱堵塞，即使在安装了预柱和每天更换流动相的情况下，该粒径的色谱柱使用寿命仍然较短（同样流动相条件下，每次柱压增加幅度达到10%以上），造成分析成本大大提高。当选用色谱柱B时，8种PFCs在10 min内能实现良好的分离，化合物峰形尖锐，信号质量高，且色谱柱便于维护，不易堵塞（同样条件下，每次柱压增幅小于1%），使用寿命大大延长。综合考虑以上因素，选择色谱柱B，即ZORBAX Eclipse plus C18（100 mm×3.0 mm，3.5 m）色谱柱既能获得良好的分离效果，又能得到合理的分析时间，且大大降低了分析成本。

2.2 质谱条件的优化

由于PFCs化学结构中具有羧基或磺酸基，因此采用负离子反应模式监测灵敏度较高。本实验采用0.1 mg/L PFCs标准溶液在负离子模式下进行母离子全扫描，调节电离电压和锥孔电压，确定各PFCs的准分子离子，并以准分子离子为母离子，对其子离子进行全扫描，优化子离子及碰撞能量，确定其中选择性最强的子离子作为监测离子，最后以多反应监测模式进行采集。8 种PFCs及其同位素标准溶液（MPFAC-MXA，质量浓度为10 μg/L）的总离子流色谱图见图1，PFCs在10 min 内全部流出，其中PFBA最先流出，PFDoDA最后流出。随着碳链的增加，全氟酸类化合物在C18柱上的保留逐渐增大，同一碳链数全氟磺酸类化合物保留强于全氟羧酸类化合物。

1. PFBA＋MPFBA；2. PFHxA＋MPFHxA；3. PFOA＋MPFOA；4. PFNA＋MPFNA；5. PFDA＋MPFDA；6. PFOS＋MPFOS；7. PFUnDA＋MPFUnDA；8. PFDoDA＋MPFDoDA。

2.3 前处理方法优化

PFCs常见的提取溶剂有离子对试剂、酸、碱和有机溶剂等，其中乙腈对大部分PFCs的提取效率大于其他溶剂[15]，本实验选择乙腈作为提取剂。在提取过程中，乙腈可以使鱼肉中大量蛋白质变性形成沉淀，然后通过离心去除蛋白沉淀。但含脂量较高的样品在用乙腈进行蛋白沉淀时，容易将样品中的部分脂肪和水溶性杂质提取出来，造成提取液混浊，在液相色谱-质谱联用分析时可能产生基质干扰和色谱柱污染，需对提取液进一步净化[16]。

本实验比较了Waters Oasis HLB和Waters Oasis WAX固相萃取柱对PFCs提取液的净化效果。当使用HLB柱进行富集后，使用5%甲醇溶液淋洗，纯甲醇洗脱时，短链PFCs损失较大；而使用WAX柱富集，目标物经5 mL醋酸盐缓冲溶液（pH 4）锁定后，再用5 mL甲醇清洗，0.5%氨水甲醇溶液洗脱时，8 种PFCs的回收率均在80%以上，因此本实验选择WAX固相萃取柱对样品提取液进行净化。

在WAX固相萃取柱上注入50 μL质量浓度为1 μg/mL PFCs标准溶液，用0.5%氨水甲醇溶液进行洗脱，分段收集洗脱组分（每1 mL收集一管），共收集10 个流分（共10 mL），由于氨水甲醇溶液（洗脱剂）pH值呈碱性，直接进行洗脱流分（每个流分1 mL）的测定峰形很差，大部分目标物出现峰分裂现象，无法准确定量，不能较好绘制出洗脱曲线。但不同流分中PFCs的总离子流图表明5 mL洗脱剂能使大部分PFCs洗脱出来。当洗脱剂用量为8 mL时，第8个组分（1 mL）中基本没有PFCs检出，为充分保证目标化合物的回收率，本实验洗脱体积定为8 mL。

2.4 线性范围、检出限、精密度和准确度

在选定的分析条件下，将0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L PFCs标准系列溶液按质量浓度从低到高的顺序依次进行UPLC-MS-MS分析测定，以内标法定量，各PFCs的线性范围和检出限如表2所示。8 种PFCs在0.1～50 μg/L范围内呈现良好的线性关系，相关系数在0.998 7～0.999 1之间。以1 g鱼肉样品经处理后定容至1 mL为计，该方法对样品中PFCs的检出限为0.03～0.15 μg/kg。

在1 g鱼肉中添加10 μL质量浓度为1 μg/mL PFCs标准溶液，添加同位素内标各10 ng，按照实验选定的最佳条件，测定8 种PFCs的加标回收率，并分析其相对标准偏差，见表2。8 种PFCs的平均加标回收率在87.7%～104.4%之间，相对标准偏差为4.1%～10.7%，说明该方法回收率较高，重复性较好，能够满足分析测定的需求。

表 2 8 种PFCs的线性范围、相关系数、方法检出限、回收率和相对标准偏差Table 2 Linear ranges, correlation coefficients, limits of detection,recoveries and relative standard deviations (RSDs) for 8 PFCs

2.5 实际样品分析

采用优化的前处理方法和分析条件，对2013年6月从丹江口水库采集的鱼样进行PFCs分析测定，结果见表3。可以看出，鱼肉中PFOA的检出率为50%，其余7 种PFCs检出率均达到100%，表明鱼体中存在着一定的PFCs污染。鱼肉中∑PFCs的含量在3.02～38.9 μg/kg之间，平均值为（16.5±13.2） μg/kg，其值低于国内其他地区[17-20]所报道的含量值。本研究中鱼样肌肉组织中PFOS的含量最高，在1.00～14.1 μg/kg之间，平均含量为（5.63±4.98）μg/kg，其次为P F U n D A（0.6 1～1 3.3 μ g/k g），这与文献[13]报道的结果基本一致。总体而言，短链PFCs在鱼类肌肉组织中富集浓度较低，长链PFCs富集相对明显且普遍。

表 3 实际鱼肉测定结果Table 3 Analytical results for actual fish musclesμg/kg

3 结 论

本实验对比了不同粒径色谱柱对PFCs的分离效果，并对样品前处理方法进行了优化，建立了同位素稀释-UPLC-MS-MS测定鱼肉中8 种PFCs的分析方法。该方法的加标回收率高，精密度较好，对实际鱼肉中8 种PFCs的分析结果表明，鱼体中存在着一定的PFCs污染。

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