衍生化气相色谱-质谱分析樟芝菌粉中脂肪酸的组成及其指纹图谱分析

张奉苏，陈 菲，刘训红*，杨念云，侯 娅，马 阳，陆娟娟

（南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023）

樟芝（Antrodia camphorata），又名牛樟芝、牛樟菇、樟内菇、红樟菇，属于非褶菌目多孔菌科，是我国台湾特有的珍稀食药两用真菌，早期原住民以樟芝作为解酒之用，近年来研究表明，樟芝含有多糖类、固醇类、三萜类、核苷类、不饱和脂肪酸、免疫蛋白等多种生理活性成分，具有解毒保肝、消除肿瘤、补肾强心、益胃整肠、强化免疫、镇痛抗菌等多方面药理作用[1-3]。樟芝作为一种极具开发潜力和应用前景的保健、药用菌，近年来逐渐成为国内外研究和开发的热点。目前，保健食品发展方向是向功能因子明确的第3代产品转移，保健功能因子的研究已引起国内外高度重视[4]。樟芝具有丰富的营养成分，脂肪酸类成分尤其是不饱和脂肪酸是樟芝保健食品重要的功能因子之一。现代研究证实，不饱和脂肪酸具有降血脂、降血压、软化血管、促进免疫以及抗炎、抗肿瘤等生理活性[5-9]，已经引起人们的广泛重视，以其作为重要功能因子的保健食品已被越来越多的人所接受。超临界CO2流体萃取法因具有操作方便、能耗低、无污染、纯度高、无溶剂残留等特点，国内外已广泛应用于植物油脂研究[10-14]。本实验在前期研究基础上[15-19]，采用超临界CO2流体萃取法提取樟芝菌粉油脂类成分，应用衍生化气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）技术分析鉴定其脂肪酸的组成，并建立其色谱指纹图谱，以期为市售樟芝菌粉及其保健食品的质量评价和控制以及樟芝新品的研发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

樟芝样品：C1～C10（普通发酵菌粉，批号分别为：02L07、02L11、02L14、02L18、02L21、02L25、02L28、03L04、03L07、03L11）、ST（三萜含量较高的发酵菌粉，批号0J10D17）、J6（樟芝胶囊，批号0J02L07）、D（椴木栽培樟芝子实体） 台湾长庚生物科技股份有限公司；CZ（赤芝） 安徽亳州药材市场。

以上样品均经南京中医药大学刘训红教授鉴定，D为多孔菌科真菌樟芝（Antrodia camphorata）的干燥子实体，C1～C10、ST及T6分别为多孔菌科真菌樟芝的发酵菌粉及其胶囊，CZ为多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum（Leyss. ex Fr.）Karst.的干燥子实体。留样凭证存放于南京中医药大学中药鉴定实验室。

氯化钠、正己烷、石油醚、氢氧化钾（均为分析纯） 南京化学试剂有限公司；三氟化硼甲醇溶液美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

7890A/5975C气相色谱-质谱联用仪、HP-5 ms毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美国安捷伦科技有限公司；HA221-50-06超临界萃取仪 南通华安超临界有限公司；HH-S型水浴锅 巩仪市英峪予华仪器厂；Anke TGL-16B离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

采用超临界CO2技术，萃取釜压力为20 MPa，萃取温度48 ℃；分离釜Ⅰ压力7 MPa，温度40 ℃；分离釜Ⅱ压力5 MPa，温度35 ℃。萃取时间90 min，CO2流速为30 L/h。称取各样品发酵菌粉100 g，过40 目筛，分别置萃取釜中萃取，从分离釜Ⅰ和分离釜Ⅱ收集样油。

称取样油200 μL，置10 mL具塞试管中，加0.4 mol/L氢氧化钾甲醇溶液2 mL，摇匀，在60 ℃水浴中放置20 min，至油珠全部消失溶液变透明，冷却至室温，加BF3-CH3OH溶液3 mL，摇匀，水浴中放置6 min，加正己烷3 mL，保持微沸3 min，取出冷却至室温，振摇，加饱和氯化钠溶液2 mL，静置，吸取上清液，加无水Na2SO4干燥后过0.22 μm滤膜待分析。

1.3.2 色谱条件

采用程序升温：初温80 ℃，以10 ℃/min升至150 ℃保持5 min，以3 ℃/min升至195 ℃保持5 min，以2 ℃/min升至230 ℃保持10 min，总计运行59.5 min。进样口温度250 ℃，分流比10∶1，载气为氮气，流速为10 mL/min。

1.3.3 质谱条件

电子电离（election ionization，EI）源；离子源温度230 ℃，电子能量70 eV，四极杆温度150 ℃，溶剂延迟时间3 min，扫描范围40～350 u，电子倍增器电压700 V。

1.4 样品分析

样品按上述分析条件进行GC-MS分析，各色谱峰相应的MS图经人工解析及G1701BA化学工作站NIST 11谱图库检索定性；根据G1701BA化学工作站数据处理系统，对各色谱峰的峰面积进行归一化处理，求得各组分的相对百分含量。根据GC-MS总离子流图的峰数、峰位和峰面积值以及成分鉴定结果，标定共有峰，建立其指纹图谱。

2 结果与分析

2.1 脂肪酸组成分析

经GC-MS检测，得到11 批樟芝菌粉、樟芝椴木栽培品以及赤芝的脂肪酸总离子流图。樟芝菌粉C8的GC-MS总离子流色谱见图1。各色谱峰相应的MS图经对照品对照及NIST 11 MS库检索定性，并根据数据处理系统对色谱峰的峰面积进行归一化处理。樟芝菌粉脂肪酸组成分析结果见表1。

目前，独立学院法学专业基本上选用与普通高校法学专业相同的本科系列教材。这些教材大多是普通高校法学本科专业的规划教材、统编教材，知识体系完整、系统，“内容过于理论化，缺乏案例分析，缺乏法律职业技能训练内容”［2］30，对独立学院法学专业的学生来说难度可想而知。

图 1 樟芝菌粉（C8）的GC-MS总离子流图Fig.1 Total ion current chromatogram (TIC) of fatty acids in Antrodia camphorata powder (C8)

2.2 指纹图谱分析

2.2.1 指纹图谱测定

对10 批次樟芝菌粉样品（C1～C10）在同一上述实验条件下进样分析，测定所有供试品的GC-MS总离子流图，见图2。根据樟芝菌粉挥发性成分GC-MS总离子流图所给出的峰数、峰保留时间和峰面积值等相关参数以及成分鉴定结果，进行分析比较，制定樟芝菌粉GC-MS指纹图谱。

表 1 樟芝菌粉中脂肪酸组成分析结果Table 1 Identified fatty acids in Antrodia camphorraattee powwddeerr编号 组分名称 分子式 保留时间/min相对百分含量/%C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 J6 D CZ ST 1辛酸甲酯 C9H18O24.5350.02 — — — — 0.01 — — — — — — — 0.01 2壬酸甲酯 C10H20O25.601— — — — — — — — — — — — 0.07 —3癸酸甲酯 C11H22O 26.7200.01 — — 0.01 — — 0.020.020.020.01 — — — 0.01 4月桂酸甲酯 C13H26O29.528 0.01 — 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 — — 0.08 0.01 5肉豆蔻酸甲酯 C15H30O214.596 0.31 0.22 0.35 0.24 0.34 0.34 0.25 0.25 0.19 0.22 0.25 0.88 0.57 0.25 6十五碳酸甲酯 C16H320217.568 0.05 0.02 0.08 0.04 0.05 0.06 0.04 0.03 0.03 0.03 0.04 1.10 0.99 0.03 7棕榈酸甲酯 C17H34O220.659 7.40 17.00 12.94 16.8 14.60 18.75 17.13 9.91 16.25 13.75 17.21 13.28 16.34 13.66 8（Z）-十六烯酸甲酯 C17H32O221.361 0.21 0.17 0.20 0.17 0.21 0.21 0.18 0.19 0.15 0.17 0.17 1.53 1.07 0.19 9（7E,10E）-十六碳二烯酸甲酯 C17H30O222.529 0.02 — 0.03 — 0.03 0.03 0.02 0.01 — — 0.02 — — 0.01 10 十七酸甲酯 C18H36O223.586 0.11 0.09 0.13 0.10 0.10 0.11 0.10 0.11 0.10 0.11 0.10 0.33 0.43 0.06 11 （10Z）-十七碳烯酸甲酯 C18H34O224.319 0.06 0.04 0.07 0.05 0.05 0.06 0.05 0.05 0.04 0.05 0.06 0.39 0.25 0.05 12 9,12-十七碳二烯酸甲酯 C18H32O225.723 0.02 — — — — — — 0.01 — — — — — —13 硬脂酸甲酯 C19H38O226.540— — — — — — — — — — — 2.474.96—14 油酸甲酯 C19H36O227.060 10.20 39.45 14.40 15.80 11.40 14.98 11.94 14.59 10.68 9.95 31.5 23.42 44.24 11.5 15 反油酸甲酯 C19H36O227.172 5.20 5.23 14.12 7.06 7.85 13.46 9.17 3.04 8.34 8.52 6.52 — 1.17 7.76 16 （11E）-十八碳烯酸甲酯 C19H36O227.824 — — — — — — 0.61 — — — — 0.32 — —17 亚油酸甲酯 C19H34O228.402 10.35 31.12 22.27 16.9 24.96 22.63 27.46 8.57 15.95 19.14 16.13 22.94 16.69 16.19 18 （8E,11E）-十 八碳二烯酸甲酯 C19H34O229.805 — — 0.04 — — — — — — — — — — —19 顺-10-十九烯酸甲酯 C20H38O230.3740.01 — — — — — — 0.01 — — — — — —20 亚麻酸甲酯 C19H32O230.6361.28 1.18 1.35 1.22 1.33 1.33 1.26 1.30 1.20 1.24 1.25 — — 1.31 21 花生酸甲酯 C21H42O233.581 0.43 0.36 0.40 0.36 0.27 0.31 0.38 0.46 0.50 0.47 0.36 — 0.59 0.39 22 （11E）-二十碳酸甲酯 C21H40O234.265 1.66 1.46 1.51 1.54 1.30 1.46 1.62 1.76 1.87 1.72 1.55 0.71 — 1.73 23 （11Z,14Z）-二十碳酸二烯酸甲酯 C21H38O236.166 0.08 0.05 0.09 0.07 0.08 0.09 0.09 0.08 — 0.07 0.08 — — 0.06 24 二十一碳酸甲酯 C22H44O237.579— — — — — — — — — — — — 0.49—25 （6Z,9Z,11E）-十八碳酸甲酯 C19H32O240.288 0.06 0.08 0.23 0.26 0.23 0.23 0.27 0.30 0.37 0.29 0.26 — — 0.18 26 山嵛酸甲酯 C23H46O241.536 0.20 0.13 0.19 0.20 0.12 0.14 0.20 0.20 0.27 0.23 0.19 1.74 1.70 0.15 27 芥酸甲酯 C23H44O242.207—0.19— — — — — — — — — — — —28 （9Z,11E,13E）-十八碳三烯酸甲酯 C19H32O242.212 0.67 0.09 0.57 0.72 0.53 0.54 0.72 0.79 0.83 0.8 0.62 1.07 — 0.32 29 二十三烷酸甲酯 C24H48O245.2190.03 — 0.02 0.03 — 0.02 0.03 0.03 0.04 0.03 — 1.01 2.12 0.04 30 木蜡酸甲酯 C25H50O248.923 0.42 0.21 0.30 0.48 0.20 0.22 0.37 0.30 0.39 0.40 0.31 5.06 3.04 0.23 31 顺-15-二十四酸甲酯 C25H48O249.585 0.13 0.14 0.11 — 0.08 0.09 0.11 0.10 0.14 0.13 0.12 0.75 — 0.11 32 二十五酸甲酯 C26H52O252.539 0.04 — 0.03 0.03 0.06 0.03 0.04 0.05 0.04 0.06 0.04 2.59 0.82 —33 21-甲基二十二碳酸甲酯 C24H48O257.230 0.21 — 0.18 0.21 0.11 0.14 0.24 0.19 0.22 0.21 0.20 5.18 — —

图 2 樟芝菌粉GC-MS指纹图谱共有模式Fig.2 GC-MS fingerprints and common pattern of 10 batches of A. camphorata powder

2.2.2 共有指纹峰标定

经对脂肪酸成分GC-MS总离子流图的分析，标定11 个共有峰作为樟芝菌粉指纹图谱的特征峰，依次为：肉豆蔻酸甲酯、十五碳酸甲酯、棕榈酸甲酯、亚油酸甲酯、花生酸甲酯、（11E）-二十碳酸甲酯、（11Z,14Z）-二十碳酸二烯酸甲酯、（6Z,9Z,11E）-十八碳酸甲酯、山嵛酸甲酯、（9Z,11E,13E）-十八碳三烯酸甲酯、木蜡酸甲酯。以棕榈酸甲酯（3号峰）为参照峰，分别求出各共有峰与之相比的α值（调整保留时间之比）和各共有峰的相对峰面积（峰面积之比），结果见表2。

表 2 樟芝菌粉GC-MS指纹图谱中共有峰的相对保留时间α值和相对峰面积Table 2 Relative retention time (α) and relative peak area of common GC-MS fingerprint peaks fromom A. camphorataata powderwder峰号 α 相对峰面积C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 5 0.707 0.042 0.013 0.027 0.014 0.023 0.018 0.015 0.025 0.012 0.016 6 0.850 0.007 0.001 0.006 0.002 0.003 0.003 0.002 0.003 0.002 0.002 7 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 17 1.375 1.399 1.831 1.721 1.006 1.710 1.207 1.603 0.865 0.982 1.392 21 1.625 0.058 0.021 0.031 0.021 0.018 0.017 0.022 0.046 0.031 0.034 22 1.659 0.224 0.086 0.117 0.092 0.089 0.078 0.095 0.178 0.115 0.125 23 1.751 0.011 0.003 0.007 0.004 0.005 0.005 0.005 0.008 0.004 0.005 25 1.950 0.008 0.005 0.018 0.015 0.016 0.012 0.016 0.030 0.023 0.021 26 2.011 0.027 0.008 0.015 0.012 0.008 0.007 0.012 0.020 0.017 0.017 28 2.043 0.091 0.005 0.044 0.043 0.036 0.029 0.042 0.080 0.051 0.058 30 2.368 0.057 0.012 0.023 0.029 0.014 0.012 0.022 0.030 0.024 0.029

2.2.3 色谱峰的重叠率

以对照谱图（R）为基准，按以下公式计算：

重叠率=（（待测样品与对照谱图共有的峰数×2/（待测样品与对照谱图峰数和））×100，C1～C10号样品色谱峰的重叠率依次为：86.66%、87.35%、86.35%、87.60%、88.45%、85.60%、86.35%、87.35%、83.34%、86.87%。

2.2.4 相似度评价

按照中位数夹角余弦法计算相似度，进行色谱峰差异性评价和整体相似性评价。各相似度值如下：C1：0.995 4，C2：0.999 0，C3：0.999 9，C4：0.999 7，C5：0.999 5，C6：0.999 8，C7：0.999 7，C8：0.998 6，C9：0.998 8，C10：0.999 8。结果显示10 批样品指纹谱相似度较好，均在0.99以上。

2.2.5 不同商品樟芝及赤芝的指纹谱比较

根据中位数夹角余弦值的相似度计算方法[20-23]，与樟芝菌粉指纹谱比较，樟芝胶囊（J6）具有11 个共有峰，夹角余弦值和中位数相关系数分别为0.999 8和0.999 7，三萜含量高的样品（ST）具有11 个共有峰，夹角余弦值和中位数相关系数分别为0.998 9和0.997 1。樟芝椴木栽培品具有8 个共有峰，赤芝具有7 个共有峰，与樟芝菌粉指纹谱差异明显。

3 讨 论

实验结果表明，樟芝菌粉中含有33 种脂肪酸，其中不饱和脂肪酸有18 种，占脂肪酸含量的75.29%，单不饱和脂肪酸占总脂肪酸的36.64%，多不饱和脂肪酸占总脂肪酸的38.65%，不饱和脂肪酸的含量是饱和脂肪酸的 3倍，以油酸和亚油酸为主，且多为人体必需脂肪酸。从而说明樟芝菌粉具有良好的营养、保健及药用价值，其开发应用前景广阔。

不同批次的台湾普通樟芝菌粉中脂肪酸组成的差异较小，显示樟芝菌粉发酵工艺的稳定。普通樟芝菌粉与三萜含量较高的樟芝菌粉的脂肪酸组成组成相似，但各化合物的相对含量不同。樟芝胶囊与普通菌粉的脂肪酸组成和含量几无差异。椴木栽培樟芝子实体及灵芝与台湾普通樟芝菌粉的脂肪酸组成在组成和含量上有较大差异。

指纹图谱分析结果表明，不同批次樟芝菌粉之间既有相关性，又有区别。相应共有指纹峰均已在色谱图上体现，色谱峰重叠率、指纹谱相似度较好，但各峰面积有所不同，说明不同批次樟芝菌粉成分含量有一定差异。棕榈酸甲酯、亚油酸甲酯、（9Z,11E,13E）-十八碳三烯酸甲酯、（11E）-二十碳酸甲酯可列为樟芝菌粉指纹谱共有特征峰中n强峰，其配比关系为1∶（0.865～1.831）∶（0.078～0.224）∶（0.005～0.091），这对评价樟芝菌粉的品质具有一定意义。经对不同商品樟芝及灵芝与樟芝菌粉指纹谱比较、分析，其共有峰数目、色谱图相似度及n强峰峰面积比值均具有一定差异。

本实验采用超临界CO2流体萃取法提取樟芝菌粉油脂类成分[24-25]，应用衍生化GC-MS技术分析鉴定其脂肪酸的组成，并建立其脂肪酸类成分GC-MS指纹图谱，从而为市售樟芝菌粉及其保健食品的质量评价和控制以及樟芝新品的研发提供实验依据。

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