通心络对冠脉微栓塞兔心肌损伤的保护机制

唐 军，张鹏程，汪和贵,柯永胜

(皖南医学院附属弋矶山医院 心内科，安徽 芜湖 241001)

冠脉微栓塞(coronary microembolization，CME)来自冠状动脉粥样硬化的易损斑块，是经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)等血运重建术常见的并发症，引起冠脉内“慢血流”或“无复流”现象，严重影响患者的预后[1]。研究报道[2-4]，通心络具有抗血栓、保护血管内皮、改善微循环及减轻心肌损伤等作用，但其在冠脉微栓塞中的作用研究较少，且机制尚未阐明。因此，本研究通过制备兔冠脉微栓塞模型，观察术前顿服负荷量通心络干预对冠脉微栓塞兔心肌损伤的影响、对血清炎症因子TNF-α、IL-1β水平及心肌组织TNF-α、IL-1β表达的影响，初步探讨通心络对冠脉微栓塞的作用机制，为临床应用负荷量通心络治疗冠状动脉微栓塞提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康成年雄性新西兰白兔40只，体质量1.6～2.3 kg，南京青龙山动物养殖场提供，动物合格证号：2017298。

1.2 药物和试剂 阿司匹林肠溶片(拜阿司匹林)，0.1 g/片，拜耳医药保健有限公司生产；阿托伐他汀钙片(立普妥)，20 mg/片，辉瑞制药有限公司生产；通心络超微粉：河北以岭药业生产。TNF-α，IL-1β定量ELASA测定试剂盒，上海蓝基生物科技有限公司提供。心肌肌钙蛋白Ⅰ检测试剂盒(cTnI)，北京康思润业生物技术有限公司提供；羊抗兔TNF-α单克隆抗体(浓缩型)，工作浓度为1∶80；羊抗兔IL-1β单克隆抗体(浓缩型)。即用型免疫组织化学试剂盒，DAB显色试剂盒等购自福州迈新生物技术公司。

1.3 实验仪器 病理组织包埋机：日本SAKURA FINETECHNICAL CO.LTD，4590型。病理组织切片机：德国莱卡公司，1512型。病理图像分析仪：德国莱卡公司，DMR+550型。生物组织自动脱水机TS-12F：湖北孝宏业医用仪器有限公司。DH-150型小动物人工呼吸机：浙江大学医疗仪器设备厂。722N型可见分光光度计：上海楚定分析仪器有限公司。锐普荧光干式cTnI定量分析仪：北京康思润业生物技术有限公司。

1.4 方法

1.4.1 模型制备及分组 根据月桂酸钠制作急性冠脉微栓塞模型方法[5-6]，新西兰兔称重后取仰卧位固定,以4.0 ml/kg在耳缘静脉静推20%乌拉坦麻醉，于颈部正中常规消毒后切开皮肤暴露气管，再横向切开气管，插入套管连接小型动物呼吸机辅助通气。取左前外侧中心切口入胸腔，逐层分离暴露至心脏及主动脉根部，钳夹升主动脉后立即用注射器将胰岛素40 U从心尖部直接注入左心室，待回血后注入月桂酸钠2.0 mg/kg(浓度2 mg/ml)，假手术组注射等量的生理盐水。夹闭20 s后，松开血管夹，心跳稳定后逐层关闭胸腔。术中监测心电监护可见ST-T压低，观察6 h后以10%氯化钾2 ml静脉注射处死。用肝素生理盐水冲洗，沿心脏长轴取约2 mm厚左心室心肌组织置10%中性甲醛固定、埋蜡、切片、HE染色。

将雄性新西兰大白兔随机分为假手术组、冠脉微栓塞组、常规药物组(阿司匹林20 mg/kg+阿托伐他汀4 mg/kg)及常规药物+通心络组：在常规药物组基础上+通心络1.0 g/kg。给药组均为术前3 h负荷量给药，各组实验动物均为10只。

1.4.2 TNF-α，IL-1β及cTnI测定 ELASA法测定血浆TNF-α，IL-1β，敏感性<1 pg/ml；肌钙蛋白Ⅰ检测：将样本吸入固相针内，cTnI与固相针内墙包被的鼠抗人cTnI单克隆抗体结合，标记碱性磷酸酶的鼠抗人cTnI单克隆抗体吸入固相针内，与待测定的cTnI结合；cTnI含量与扣除本底后的荧光值成正比，在450 nm处检测其荧光值。仪器通过多点定标曲线自动计算样本中cTnI浓度。

1.4.3 免疫组化 取石蜡包埋心脏标本，沿左室长轴行4 μm厚度连续切片，分别取5个切片；PBS洗3次，高压修复抗原；3%过氧化氢室温孵育10 min；正常山羊血清孵育10 min；一抗湿盒内孵育,37 ℃ 1.5 h，第二抗体孵育10 min；链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液孵育10 min；DAB显色液；苏木素复染，中性树胶封片。

2 结果

2.1 通心络对冠脉微栓塞心肌损伤标志物cTnI水平的影响 由表1可见术前各组血清cTnI水平无明显变化(P>0.05)；术后6 h除假手术组与术前比较没有明显差异外，其余各组均有明显的升高(P<0.01)，提示采用月桂酸钠制备兔冠状动脉微栓塞模型是成功的。术后6 h与微栓塞组比较，常规药物组及常规药物+通心络组cTnI水平明显降低(P<0.05)；与常规药物组比较，常规药物+通心络组cTnI水平亦明显降低(P<0.05)，提示通心络对冠脉微栓塞心肌损伤起保护作用。

表1 各组血清cTnI的变化

2.2 通心络对冠脉微栓塞兔心肌组织病理学的影响 由图1可见，术后6 h假手术组(A)心肌细胞排列整齐，无间质水肿，未见微梗死灶；微栓塞组(B)心肌内可见明显微梗死灶，间质水肿，炎性细胞浸润；常规药物组(C)心肌内可见少量微梗死灶及炎性细胞浸润，程度较微栓塞组明显减轻；常规药物+通心络组(D)心肌微梗死灶进一步减少，炎症细胞浸润减轻，结果亦提示通心络保护冠脉微栓塞兔的心肌损伤。

A：假手术组；B：微栓塞组；C：常规药物组；D：常规药物+通心络组

2.3 通心络对冠脉微栓塞兔血清炎症因子TNF-α、IL-1β水平的影响 为了探讨通心络对冠脉微栓塞兔心肌损伤保护作用机制，首先采用ELASA法检测各组血清炎症因子TNF-α、IL-1β的水平。由表2可见术后6 h微栓塞组较假手术组血清TNF-α、IL-1β水平明显升高(P<0.01)；与微栓塞组比较，常规药物及常规药物+通心络组TNF-α、IL-1β水平明显降低(P<0.01)；与常规药物组比较，常规药物+通心络组TNF-α、IL-1β水平亦明显降低(P<0.05，P<0.01)，结果提示通心络降低冠脉微栓塞兔血清炎症因子TNF-α、IL-1β的水平。

表2 通心络对冠脉微栓塞兔血清炎症因子TNF-α、IL-1β水平的影响

2.4 通心络对冠脉微栓塞兔心肌组织TNF-α表达的影响 为了进一步探讨通心络对冠脉微栓塞兔心肌损伤保护作用机制，观察通心络对冠脉微栓塞兔心肌组织TNF-α表达的影响。假手术组心肌细胞仅表达少量TNF-α；微栓塞组在微梗死灶内、非梗塞血管周边的心肌及血管内皮TNF-α均强表达；常规药物组仅在微梗死灶内可见TNF-α阳性表达的细胞；常规药物+通心络组心肌细胞TNF-α表达较常规药物组明显减少(图2)。

箭头示红色颗粒细胞为TNF-α阳性表达细胞A：假手术组；B：微栓塞组；C：常规药物组；D：常规药物+通心络组

2.5 通心络对冠脉微栓塞兔心肌组织IL-1β表达的影响 IL-1β在假手术组小血管内及心肌细胞弱表达；微栓塞组IL-1β在小血管内和微梗塞灶内心肌细胞强表达；常规药物组在小血管内可见IL-1β阳性表达的细胞；常规药物+通心络组IL-1β阳性表达的细胞较常规药物组明显减少(图3)。棕红色颗粒细胞为IL-1β阳性表达细胞。

A：假手术组；B：微栓塞组；C：常规药物组；D：常规药物+通心络组

3 讨论

冠脉微栓塞(CME)是经皮冠状动脉介入术(PCI)常见的不良事件，其发生机制可能有易损斑块脱落、内皮损伤、血小板激活等。冠脉微栓塞可引起炎症反应、心脏收缩功能不全、无复流或慢血流，导致心肌微梗死。因此，如何减少CME的发生及改善CME引起的心肌损伤具有重要的临床意义。临床上冠脉微栓塞的栓子可以由破溃的冠脉粥样硬化斑块、血小板、内皮细胞等具有生物活性的物质构成，本实验通过注射月桂酸钠制作冠脉微栓塞模型，符合临床冠脉微栓塞的改变。

通心络运用中医络病学说研制而成，由人参、水蛭、全蝎、土鳖虫等中草药组成，可益气活血、通络止痛，具有抗栓、保护血管内皮、改善微循环及减轻心肌损伤等作用。

张海涛等[7]研究表明在心肌梗死再灌注前2 h给予大剂量通心络，可显著降低再灌注后细胞粘附和促炎症因子如：血清P-选择素、细胞间粘附分子-1、IL-6，调高抗炎症因子如IL-10水平，抑制TNF-α和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的合成，减轻血管内皮损伤和心肌组织炎症浸润并缩小心肌无复流面积。Li Xiangdong等[8-9]报道单一低负荷量通心络通过上调eNOS丝氨酸(1179)和丝氨酸(635)位点的磷酸化，介导蛋白激酶A通路，降低无复流及心肌缺血再灌注损伤，缩小梗死面积；同时进一步阐明通心络通过蛋白激酶A通路抑制心肌炎症、细胞凋亡和水肿。陈章炜等[10]报道CME后血清TNF-α水平更早达到峰值，血清cTnT亦升高，但达峰偏晚，提示二者结合对早期发现和诊断CME起重要作用。Jia Yongliang等[11]研究表明通心络在单药或联合应用中疗效均优于消心痛。Zhang Huatian等[12]报道在ENLEAT试验中，急性心肌梗死急诊PCI治疗术后常规使用通心络可降低无复流梗死心肌面积。

目前术前负荷量通心络在CME中的作用如何？其机制亦尚未阐明。本研究采用心腔内注射月桂酸钠制备兔CME模型，结果表明CME组血清cTnI水平显著升高，心肌内可见明显微梗死灶，炎性细胞浸润，血清TNF-α、IL-1β水平显著升高，微梗死灶内及血管内皮TNF-α与IL-1β均强表达；在常规药物的基础上负荷量通心络显著降低CME兔血清cTnI水平，缩小心肌微梗死灶，减轻炎症细胞浸润，降低血清炎症因子TNF-α、IL-1β水平，降低心肌组织TNF-α与IL-1β的表达水平。Zhang Lei等[2]研究表明通过增加通心络的剂量可增加易损斑块稳定性。本次研究首次报道术前负荷量通心络给药可能通过抑制促炎症因子，减轻CME引起的心肌损伤，提示急性冠脉综合征患者在PCI术前给予中药通心络可以减轻微栓塞引起的心肌损伤。

【参考文献】

[1] MORISHMA I,SONE T,OKMUM K,etal.Angiographic no-reflow phenomenon as a predictor of adverse long term outcome in patients treated with percutaneous transluminal coronary angioplasty for first acute myocardial infarction[J].Am Coll Cardial,2000,36:1202-1209.

[2] ZHANG LEI,LIU YAN,LU XAIOTING,etal.Traditional Chinese medication Tongxinluo dose-dependently enhances stability of vulnerable plaques:a comparison with a high-dose simvastatin therapy[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2009,297:H2004-H2014.

[3] BAI WEIWEI,XING YONGFANG,WANG BIN,etal.Tongxinluo Improves Cardiac Function and Ameliorates Ventricular Remodeling in Mice Model of Myocardial Infarction through Enhancing Angiogenesis[J].Evid Based Complement Alternat Med,2013,2013:813247.

[4] CHEN ZHANGQIANG,HONG LANG,WANG HONG.The effects of tongxinluo capsule on platelet activities and vascular endothelial functions as well as prognosis in patients with acute coronary syndrome undergoing percutaneous coronary intervention[J].Heart,2011,97:A153-A154.

[5] 綦海,张毛毛,吴健，等.月桂酸钠致心肌微循环栓塞机制的研究[J].中国医学前沿杂志,2011,3(6):55-59.

[6] 陆永光,李浪.急性冠状动脉微栓塞动物模型的研究进展[J].心血管病学进展,2010,31(3):452-453.

[7] 张海涛,杨跃进,程宇彤,等.通心络预给药2 h对猪急性心肌梗死再灌注后心肌无再流和细胞因子变化的影响[J].中国中西医结合杂志,2009,29(9):821-824.

[8] LI XIANGDONG,YANG YUEJIN,GENG YONGJIAN,etal.Tongxinluo reduces myocardial ischemia-reperfusion injury and no-reflow by stimulating the phosphorylation of eNOS via the PKA pathway[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2010,299(4):H1255-1261.

[9] LI XIANGDONG,YANG YUEJIN,CHENG YETING,etal.Protein kinase A-mediated cardioprotection of Tongxinluo relates to the inhibition of myocardial inflammation,apoptosis,and edema in reperfused swine hearts[J].Chin Med J (Engl),2013,126(8):1469-1479.

[10] 陈章炜,钱菊英,马剑英，等.轻度冠状动脉微栓塞后TNF-α和cTnT的变化[J].中国分子心脏病学杂志,2010,10(5):310-313.

[11] JIA YONGLINAG,BAO FEIFEI,HUANG FANGYI,etal.Is tongxinluo more effective than isosorbide dinitrate in treating angina pectoris?A systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials[J].J Altern Complement Med,2011,17(12):1109-1117.

[12] ZHANG HUATIAN,JIA ZENGHE,ZHANG JIE,etal.No-reflow protection and long-term efficacy for acute myocardial infarction with Tongxinluo:a randomized double-blind placebo-controlled multicenter clinical trial (ENLEAT Trial)[J].Chin Med J (Engl),2010,123(20):2858-2864.