细菌基因组DNA提取方法简化的研究

冯唐锴 赵文亮

(景德镇学院生物与化学工程系，江西 景德镇 333000)

DNA提取是生物学领域最基础的操作，是科研和生产中常用的方法。目前DNA提取分离的常见方法，一般是用CTAB、SDS等缓冲液裂解细胞，而后通过酚氯仿抽提蛋白质，再用乙醇沉淀的方法来抽提DNA。该过程干扰因素多、工艺繁琐。目前广泛认为核酸提取过程中低温是必备条件，通常用液氮冷却。但是液氮并非所有地区都能够生产，运输也很麻烦。如能利用化学试剂替代液氮的作用，并进一步简化核酸提取方法，对促进生物基因资源的利用有着重大的意义。本文正是基于这一考虑，探索和研究了细菌DNA提取中尽可能简化的方式。

1 实验材料与方法

1.1 材料

菌种:大肠杆菌tg1。培养基:牛肉膏蛋白胨标准培养基。电泳介质:1%琼脂糖凝胶。

1.2 两个菌种的扩大培养和保存

大肠杆菌tg1的扩大培养和保存。无菌条件下将0.2ml大肠杆菌tg1菌液接种至200ml。

牛肉膏蛋白胨液体培养基中。36℃恒温振荡培养36h。取培养的菌体悬浮液在平板培养基上划线恒温培养36h。在平板上挑取分离纯化的菌落接种在1000ml液体培养基中，36℃培养36h后，部分菌液按照菌液:甘油=3:7的比例，制成0.5ml的甘油保种菌液。

1.3 改良CTAB法提取细菌基因组DNA

收集大肠杆菌Tg1菌体沉淀，悬浮于1ml TE溶液(PH8.0)，先后加入10%SDS溶液0.5ml、5mol/LNaCl溶液0.15ml、CTAB/NaCl溶液0.15ml，混匀，65℃保温20min。5000rpm离心10min，上清液分装至1.5ml离心管，0.5ml每管。等体积的酚:氯仿:异戊醇(25∶24∶1)。

抽提，5000rpm离心10min，取上清。加1倍体积异丙醇颠倒混匀，4℃静置2h，10000rpm离心15min得DNA沉淀。70%乙醇漂洗DNA沉淀后，将沉淀溶解于TE溶液中，-20℃保存。

1.4 琼脂糖凝胶电泳检测DNA

取TAE电泳工作缓冲液100ml加入1g琼脂糖在微波炉中加热至沸腾，振荡溶解后摇匀。溶胶倒入胶槽，加入胶槽配套梳子，冷却成凝胶后，拔出梳子，将胶槽置于装满TAE电泳工作缓冲液的电泳槽中进行电泳。取1μl DNA样品与0.2μl浓度为1%的溴酚蓝指示液混匀，用移液枪点加入点样孔中。点样孔在负极一端，稳定电压120V，电流50mA开始电泳，直至溴酚蓝指示液到达凝胶的2/3处为止。电泳完毕后将凝胶移入低浓度EB溶液中染色30min，在凝胶成像系统中选择波长254nm的紫外灯下照射并观察染色后的凝胶。

2 结果与讨论

2.1 实验结果

大肠杆菌培养得到1000ml液体菌液，用1.5ml离心管分装20支0.5ml的甘油保种菌液，冷藏备用。其余菌液用于DNA提取，提取结果能够明显观察到白色沉淀。琼脂糖凝胶电泳染色后，在凝胶成像系统中能观察到明显的基因组DNA条带，如图1所示。

2.2 讨论

细菌DNA提取是生物学领域一种常见的操作。本文的方法在DNA提取常用方法［1］基础上做了简化。实验过程中发现，细菌细胞破壁时间不够，会严重影响产物的生成。使用菌液不足也会影响实验结果。一倍体积异丙醇沉淀DNA的操作如改用2倍体积的乙醇，效果要略差一些，但是或可进一步调整乙醇用量。用异戊醇替代异丙醇时，DNA得率较差。DNA静置沉淀时间一般要求为12h，但是如果菌液使用量较大，则缩短至2h也可得到理想结果。省略NaAc溶液漂洗DNA沉淀的过程，对DNA粗提取影响不大。

3 展望

本文中的提取方法相对传统方法而言进行了简化，但是简化得还不够彻底，各步骤之间的整合集成程度还不够。植物、动物样品的DNA提取过程中，还要考虑到许多其他因素，如次生代谢产物和蛋白质等对DNA提取的影响，其DNA的提取该如何简化还有待进一步研究。有文献提到可用玻璃珠法提取DNA，景德镇的陶瓷材料产业和科研十分发达，今后或可考虑利用一些特种陶瓷材料代替玻璃珠，来辅助核酸的提取纯化。核酸提取方法的简化，为分子生物学一般方法的推广提供了前提条件，对生物技术的应用和普及具有重要意义。

［1］宫强，关道明，王耀兵等.大肠杆菌总DNA快速提取方法的比较研究［J］.海洋环境科学，2005，24(4):63-66.