液相色谱⁃质谱法直接进样测定水中丙烯酰胺的基质效应

秦迪岚，罗岳平，田 耘，朱 颖，郭 倩，刘荔彬

湖南省环境监测中心站国家环境保护重金属污染监测重点实验室，湖南长沙410019

液相色谱⁃质谱法直接进样测定水中丙烯酰胺的基质效应

秦迪岚，罗岳平，田 耘，朱 颖，郭 倩，刘荔彬

湖南省环境监测中心站国家环境保护重金属污染监测重点实验室，湖南长沙410019

采用柱后注射法和前处理后添加法评定高效液相色谱⁃串联质谱法（LC⁃MS⁃MS）的基质效应，研究了不同色谱条件对水样丙烯酰胺测定中基质效应的影响，提供了有效削减基质效应的方法，并建立了直接进样测定水中丙烯酰胺的LC⁃MS⁃MS法。研究表明，流动相溶剂强度、添加剂种类及浓度对LC⁃MS⁃MS直接进样测定水中丙烯酰胺的基质效应影响显著；通过调节流动相溶剂强度和甲酸高度使丙烯酰胺保留时间与基质效应出现的时间段错开，可避开基质效应；在10%甲醇⁃90%水流动相中添加0.01%～0.02%甲酸可显著降低基质效应，对水中丙烯酰胺的检出限为0.03 μg／L，对自来水、地表水、地下水的加标回收率为96.7%～105%，相对标准偏差为1.7%～6.4%。建立的LC⁃MS⁃MS直接进样法简便、快速、灵敏度高、定性定量准确可靠，适合水中丙烯酰胺的超痕量分析。

高效液相色谱⁃串联质谱；基质效应；丙烯酰胺；水

丙烯酰胺是一种水溶性的小分子有机物，是合成聚丙烯酰胺的单体，而聚丙烯酰胺广泛应用于水净化、纸浆加工及管道内涂层等领域。丙烯酰胺具有神经毒性、发育毒性及生殖损害作用，国际癌症研究中心（IARC）将其列为人类可能致癌物（IIA）［1］。由于饮水是人类摄入丙烯酰胺的一条重要途径，世界卫生组织（WHO）规定饮用水中丙烯酰胺的最高限量不得超过1 μg／L［2］，中国的限量更低，规定饮用水及地表水源地中其标准限值为0.5 μg／L。目前，水中丙烯酰胺的常用检测方法有气相色谱法、气相色谱⁃质谱法、高效液相色谱法、高效液相色谱法⁃串联质谱法等［2⁃5］。气相色谱法及气相色谱⁃质谱法需要溴化衍生，步骤繁琐，干扰因素多且方法稳定性差；高效液相色谱法前处理简单，无需衍生化，但灵敏度不够且易受干扰。高效液相色谱⁃串联质谱法以其前处理简单、抗干扰强、灵敏度高等优点，为实现水中痕量丙烯酰胺的简便、超灵敏、高选择性检测提供了一种强有力的技术手段。

串联质谱以特异性强著称，但越来越多的数据表明，质谱检测同样需要注意避免基质效应［6⁃8］。LC⁃MS⁃MS的基质效应由共流出的基质与目标物竞争影响接口离子化效率所致，表现为离子抑制或增强作用，是影响LC⁃MS⁃MS测定准确度及精密度的主要因素。因此，LC⁃MS⁃MS分析时必须考察基质效应［6，9⁃10］。然而，国内文献的LC⁃MS⁃MS方法验证中较少考察基质效应［11⁃13］。由于丙烯酰胺是水溶性的小分子，极性较强，在反相色谱柱上的保留时间较短，极易受到基质效应的影响。因此，抑制基质效应是建立准确可靠的水中丙烯酰胺的LC⁃MS⁃MS直接进样法的必要前提。

采用柱后注射法和前处理后添加法2种方法从不同角度评定LC⁃MS⁃MS直接进样测定水中丙烯酰胺的基质效应，考察不同色谱分离条件对自来水、地表水及地下水样品基质效应的影响，最大程度地削减基质效应，从而建立适用于水中痕量丙烯酰胺检测的简便、灵敏、准确及可靠的LC⁃MS⁃MS直接进样法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LC⁃20A高效液相色谱仪（SHIMADZU），API 3200三重四极杆质谱仪（AB SCIEX，配有电喷雾ESI离子源）。

丙烯酰胺：1 000 μg／L（溶剂甲醇，编号M⁃8032）；超纯水：电阻率为18.2 MΩ·cm；甲醇：TEDIA色谱纯；甲酸：ROE色谱纯；醋酸铵：ROE色谱纯。

1.2 色谱质谱条件

Shim⁃pack VP⁃ODS色谱柱（150 mm×2.0 mm，4.6 μm）；流动相为10%的甲醇⁃90%甲酸水溶液（体积分数0.02%），柱温40℃，进样量：10 μl，流速0.3 mL／min。

质谱参数：ESI正离子模式，采用多反应监测（MRM）方式定量，丙烯酰胺的母离子／子离子为72.0／55.0，解簇电压（DP）为30 V，碰撞能量（CE）为15 V，入口电压（EP）为7 V，碰撞出口电压（CXP）为2.5 V，离子喷雾电压（IS）5 500 V，离子源温度（TEM）为650℃，气帘气流速（CUR）为137.90 kPa，碰撞气流速（CAD）为34.48 kPa，雾化气流速（GS1）为275.80 kPa，辅助气流速（GS2）为344.75 kPa。

1.3 样品采集与处理

水样用磨口玻璃器皿采集，采样时不留顶上空间和气泡，尽快分析。若不能及时分析，应在4℃冰箱中保存。

分析时，水样用0.22 μm混合纤维素滤膜过滤后直接上机分析。

1.4 基质效应的评定方法

采用柱后注射法和前处理后添加法2种方法评价LC⁃MS⁃MS的基质效应。柱后注射法是一种动态的方法，将注射泵和连接色谱柱的液相系统通过三通接头与质谱连接（图 1），注射泵以10 μL／min的速度恒流注射20 μg／L丙烯酰胺标准溶液，不含目标物的水样经过滤后从自动进样器按已定的色谱条件进样，记录丙烯酰胺在整个色谱循环中响应信号的变化，从而判定基质效应出现的时间与影响程度。

图1 柱后注射法示意图

前处理后添加法通过比较经前处理后添加目标物的水样与目标物纯标准品溶液的信号峰峰面积来衡量基质效应的大小，其计算公式为

式中：ME为基质效应，%；A0为目标物纯标准品溶液测得的峰面积；A1为水样经前处理后添加相同浓度的目标物测得的峰面积。当ME大于100%时，基质效应表现为离子增强；而ME小于100%时，基质效应表现为离子抑制。

2 结果与讨论

2.1 流动相添加剂种类对于基质效应的影响

首先采用前处理后添加法考察以最常用的甲醇⁃水作为流动相时LC⁃MS⁃MS直接进样法测定水中丙烯酰胺基质效应的大小。流动相组成根据文献［14］选择10%甲醇⁃90%水；水样选择与人类饮水密切相关的自来水、地表水和地下水3类样品，分别采自分析实验室、湘江株洲段下游饮用水源地和株洲霞湾港。水样经0.22 μm微孔滤膜过滤后，添加1.00 μg／L丙烯酰胺，以LC⁃MS⁃MS直接上机测定，各加标水样的色谱图如图2（a）所示。可见，丙烯酰胺的出峰时间在1.81 min，自来水和地表水样品中丙烯酰胺的峰形较好，但峰面积小于纯水样品，基质效应为80%；地下水样品在1.2～3.0 min呈现出很强的基质效应，并掩盖了丙烯酰胺的峰，无法定量。水环境介质尤其是地下水中存在的大量水溶性无机离子与丙烯酰胺难以在C18柱上有效分离，与丙烯酰胺共同流出，影响到电喷雾接口的离子化效率，造成基质干扰。因此，如何抑制基质效应是采用LC⁃MS⁃MS直接进样测定水环境样品特别是硬度较大的地下水样品中丙烯酰胺的技术瓶颈。

图2 采用前处理后添加法比较不同流动相添加剂对水样基质效应的影响

甲酸、醋酸铵是LC⁃MS⁃MS中常用的流动相添加剂，具有调节流动相pH、离子强度和改善峰形等作用。在甲醇⁃水流动相中分别添加醋酸铵、甲酸，比较2种添加剂对改善基质效应的作用。流动相添加2 mmol／L醋酸铵后各加标水样的色谱图如图2（b）所示。可见，自来水和地表水样品的基质效应为95%，但峰面积和信噪比分别下降为添加前的11.9%、33.2%；地下水样品在1.5～2.4 min呈现较强的基质效应，干扰丙烯酰胺峰，仍难以准确定量。由此可见，添加醋酸铵可以抑制洁净的自来水、地表水的基质效应，但无法消除离子强度较大的地下水样品的基质效应，并极大地降低了峰信号。往流动相添加0.1%甲酸后各加标水样的色谱图如图2（c）所示。可见，各样品丙烯酰胺的峰形均很好，峰面积虽下降了56.5%，但信噪比未下降，基质效应为 96% ～109%，表明甲酸的添加显著抑制了水样的基质效应，后续实验选择甲酸作为流动相添加剂。

2.2 流动相溶剂强度对于基质效应的影响

流动相溶剂强度影响丙烯酰胺的保留时间，甲醇含量越高，丙烯酰胺的保留时间越短，但对样品中无机离子保留值的影响不大。丙烯酰胺的出峰时间应避开基质效应较强的时间段。首先采用柱后注射法动态分析整个色谱循环的基质效应，各水样丙烯酰胺信号随时间的变化曲线如图3所示。由于注射泵恒速连续泵入等浓度的丙烯酰胺，若无基质效应影响，信号应为一平台；而基质效应为离子增强时，信号将增大；基质效应为离子抑制时，信号将下降。由图3可见，各水样在1.0 min附近出现负峰，由进样所致，为死时间；纯水样品在此后的色谱周期中信号平稳，无基质效应出现；自来水、地表水样品在1.6 min附近出现正峰；而地下水样品在1.5、2.0 min附近分别出现2个正峰。依图3推断，当丙烯酰胺保留时间正好位于这些时间段时，将出现较强的基质干扰现象。

图3 柱后注射法监测水样的基质效应（流动相为10%甲醇⁃90%甲酸水溶液，甲酸体积分数为0.1%）

采用前处理后添加法定量考察了不同溶剂强度对各水样丙烯酰胺保留时间以及基质效应的影响，并验证基质效应大小与丙烯酰胺保留时间、基质效应发生时间段的相关性，如表1所示。当流动相中甲醇的体积分数为20%时，甲醇含量较高，丙烯酰胺出峰时间较早，为1.6 min，对地表水、自来水样品分析时，恰处基质效应最强的区域（图3），基质效应为156%；而地下水的基质干扰略低。当甲醇体积分数为5%时，甲醇含量很低，丙烯酰胺出峰时间推迟至2.0 min，地表水、自来水无基质干扰，但对地下水样品分析时，恰处基质效应最强的区域（图3），基质效应为124%。当甲醇体积分数为10%时，丙烯酰胺出峰时间为1.8 min，地表水和自来水样品无基质干扰，地下水样品的基质效应略微偏高，为109%。由此可见，通过调节流动相甲醇的含量使丙烯酰胺保留时间与基质效应发生时间错开，可减小基质效应的影响。综合来看，在流动相添加0.1%甲酸的情况下，甲醇体积分数为10%时，对于3种实际水样的整体基质效应最低。

表1 采用前处理后添加法比较流动相不同甲醇含量对基质效应的影响

2.3 甲酸用量对于基质效应和信噪比的影响

在固定流动相甲醇体积分数为10%的情况下，同时采用柱后注射法和前处理后添加法考察不同甲酸添加量对基质效应的影响。柱后注射法展现了基质效应发生时间段随甲酸用量的变化规律，如图4所示。随着甲酸体积分数从0.1%减小到0.01%，各水样基质效应发生的时间段向后推移，当甲酸体积分数降至0.01% ～0.02%后，基质效应推移至2.0 min后，与丙烯酰胺出峰时间有效错开，最大程度地消减了样品的基质干扰。采用前处理后添加法比较甲酸用量对不同水样基质效应的定量影响，如表2所示。

图4 采用柱后注射法比较流动相中不同甲酸含量对水样基质效应的影响

表2 采用前处理后添加法比较不同甲酸含量对基质效应的影响

当甲酸体积分数为0.1%时，地下水样品出现一定的基质干扰；当甲酸体积分数降至0.05%时，基质效应推移至1.8 min左右，与丙烯酰胺出峰时间重合，各样品基质效应均有增加；随着甲酸体积分数降至0.01%～0.02%，各样品基质效应基本消除；当甲酸的体积分数为0.02%时，各样品的基质效应为97%～100%，干扰最小，后续实验确定甲酸体积分数为0.02%。

甲酸的用量还影响检测灵敏度。由图5可见，随着甲酸体积分数从0.1%降至0.01%，峰面积由1.78×103增至2.93×103，信噪比由67增至82。甲酸体积分数为0.01%～0.02%时，对提高检测的灵敏度是有利的。

图5 甲酸用量对丙烯酰胺峰面积和信噪比的影响

2.4 标准曲线和检出限

丙烯酰胺的LC⁃MS⁃MS标准色谱图如图6所示。将丙烯酰胺标准溶液用纯水稀释，配制成质量浓度为 0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00 μg／L的标准系列，以LC⁃MS⁃MS直接进样测定，以峰面积（y）对丙烯酰胺质量浓度（x）绘制标准曲线，回归方程为y＝4.248x－40.8，相关系数为0.999 9。对 0.10 μg／L的空白加标水样，经0.22 μm滤膜过滤后以LC⁃MS⁃MS测定，重复7次，按照 MDL＝St（n－1，0.99）（在99%的置信区间，t6，0.99＝3.143）计算方法检出限，结果为0.03 μg／L，可满足《地表水环境质量标准》（GB 3838—2002）规定的集中式生活饮用水地表水源地丙烯酰胺标准限值的要求。

图6 丙烯酰胺标准色谱图

2.5 方法精密度和准确度

将丙烯酰胺标准溶液加入纯水及实际水样中，添加后丙烯酰胺终浓度分别为0.40、1.00、4.00 μg／L，按实验操作考察丙烯酰胺在纯水与自来水、地表水和地下水等样品中的回收率和精密度，结果如表3所示。

表3 LC⁃MS⁃MS直接进样测定水中丙烯酰胺的准确度与精密度

在纯水介质中，方法的加标回收率为96.7%～100%，相对标准偏差为1.9% ～5.8%，准确度和精密度均能满足实验要求。该法用于自来水、地表水、地下水等水样测定的加标回收率为96.8%～105%，相对标准偏差为1.7% ～6.4%，表明方法准确可靠。

3 结论

采用柱后注射法和前处理后添加法评定LC⁃MS⁃MS的基质效应，可以判断基质效应在色谱循环中出现的时间段并对基质效应进行定量分析，据此筛选出适合的流动相添加剂并优化色谱分离条件以提高目标物与基质的分离度，可为减小LC⁃MS⁃MS的基质效应提供解决方案。在优化后的色谱条件下，采用LC⁃MS⁃MS直接进样测定水样中的丙烯酰胺，方法灵敏度高、准确度高、精密度好、方便快捷，可满足对自来水、地表水、地下水等水样中痕量丙烯酰胺监测的要求。

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Research on the Matrix Effect in Direct⁃Injection Liquid Chromatography⁃Mass Spectrometric Determination of Acrylamide in Water

QIN Di⁃lan，LUO Yue⁃ping，TIAN Yun，ZHU Ying，GUO Qian，LIU Li⁃bin
Hunan Province Environmental Monitoring Centre，State Environmental Protection Key Laboratory of Monitoring for Heavy Metal Pollutants，Changsha 410019，China

An optimized direct⁃injection high performance liquid chromatography⁃tandem mass spectrometry（LC⁃MS⁃MS）method by diminishing the matrix effect has been developed for detection of acrylamide in water.The influence of different chromatographic conditions on the matrix effect was investigated with the post⁃column infusion method and the addition⁃after⁃pretreatment method.The results indicated that chromatographic conditions such as the solvent intensity of mobile phase and content of the additive in mobile phase had dramatic effects on the matrix effect.The matrix effect could be eliminated by adjusting mobile phase ratio and the species and formic acid content to separate the acrylamide peak from matrix peaks，such as with a mobile phase consisting of 10%methanol and 90%water containing 0.01%⁃0.02%formic acid.The detection limit of the optimized direct⁃injection LC⁃MS⁃MS method was 0.03 μg／L.The recoveris and relative standard deviations were 96.7%⁃105%and 1.7%⁃6.4%respectively for acrylamide in real water samples including tap water，suface water and groundwater. This method is simple，rapid，sensitive and accurate for ultra⁃trace analysis of acrylamide in water.

high performance liquid chromatography⁃tandem mass spectrometry；matrix effect；acrylamide；water

X832.02

A

1002⁃6002（2014）06⁃0142⁃06

2013⁃11⁃26；

2014⁃02⁃19

秦迪岚（1980⁃），女，广西阳朔人，博士，高级工程师.