利用复式PCR检测牛奶中掺杂的大豆源性成分

韩镌竹，苏崴艺，李欣南

(辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心，沈阳110016)

0 引 言

随着社会经济的高速发展人民生活水平日益提高，牛奶已经成为人们餐桌上必不可少的食物之一，随之产生的经济效益也越来越高。一些不法商贩为谋取暴利，在牛奶中违法添加有毒有害物质，掺假造假现象严重，牛奶的质量安全问题已经成为国内外研究的热点与重点[1-4]。由于大豆价格低廉，蛋白含量高，通用蛋白测定方法难以从牛奶中区分开[5]，在牛奶中掺入大豆已成为掺假的主要手段之一。目前牛奶中掺杂植物蛋白的研究很少，有研究羊奶中掺杂的牛奶[6]；荧光PCR方法实时检测牛奶中掺杂大豆成分[7]的实验等，但是复式PCR还是一个比较崭新的领域。复式PCR具有敏感、特异、快速等特点，检测大批样本效率较传统方法高数倍，成本低，可以更加准确的检测出牛奶中掺杂的大豆源性物质。

1 仪器与材料

1.1 仪器

CF16RX高速低温冷冻离心机，TC-512PCR仪，DYY-6C型电泳仪，170-8170型紫外凝胶成像系统，AL 104-IC电子天平。

1.2 试剂与材料

基因组DNA提取试剂盒，TritonX-100、异硫氰酸胍(分析纯)，牛奶、豆浆粉(市售)；试验所用引物均为南京金斯瑞生物科技有限公司合成，序列如表1所示。

表1 引物序列

2 方 法

2.1 不同体积分数豆浆的牛奶的配制(是按照质量分数配置的豆浆牛奶)

准确称取3.0 g豆浆粉溶于30 mL温开水中，制成豆浆溶液，分别配制体积分数为3%，4%，5%，10%豆浆的牛奶。

2.2 牛奶和大豆的基因组DNA提取方法

2.2.1 热解法提取基因组DNA

分别取2.1制备样品10 mL于50 mL离心管中，4℃，4 000 r/mim离心10 mim，用棉签擦去管壁上的乳蛋白和乳脂，重复离心擦拭步骤3次。加入10 mL的PBS(8.0g NaCl+0.2g KCl+1.44g Na2HPO4+0.24 g KH2PO4定容至1 000 mL)重新悬浮，轻轻震荡，重复离心擦拭步骤一次。

分别取200 μL上述样品于1.5 mL的Eppendorf管中，加入440 μL TEN(1mL浓度1 mol/L的Tris+0.2 mL浓度0.5 mol/L的EDTA+0.5844 g的NaCl定容至100 mL)和60 μL 0.2 mol/L NaOH,剧烈振荡，直到沉淀完全悬浮，取600 μL上述裂解液置于1.5 mL Eppend orf管中，95℃水浴8 min，冷却后离心取上清液。加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，混匀，4 ℃，12 000 r/min，离心10 min，取上清液。加入3 μL RNaseA，37℃水浴30 min。加入0.8倍体积异丙醇，-20℃沉淀30 min,70%乙醇洗涤沉淀，室温干燥10 min，加入30 μL TE(121.14 mg+37.224 mg EDTA,加HCl调pH至8.0，定容至100 mL)溶解，-20℃保存备用。

2.2.2 异硫氰酸胍法提取基因组DNA

从离心管中分别取200 μL 2.1制备样品于1.5 mL Eppendorf管中，加入400 μL异硫氰酸胍裂解液，混匀，室温放置10 min，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，充分混匀，12 000 r/min离心10 min。 取上清，加入0.8倍体积异丙醇，-20℃沉淀30 min，12 000 r/min离心10 min，弃上清，用体积分数为70%乙醇洗涤沉淀，室温干燥20 min，加入30 μL TE溶解，-20 ℃保存备用。

2.2.3 基因组DNA提取试剂盒法

用棉签沾取样品于2 mL离心管中，加入400 μL的Buffer GR。 加入20 μL Proteinase K和400 μL Buffer GL，立即涡旋震荡15 s，充分混匀，56℃水浴10 min，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。

将上步所得溶液和沉淀分两次加入到已装入收集管的吸附柱中，一次最多不超过700 μL。8 000 r/min离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。向吸附柱中加入500 μL Buffer GW1,8 000 r/min离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。向吸附柱中加入500 μL Buffer GW2,14 000 r/min离心3 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

14 000 r/min离心1 min，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，干燥处理。将吸附柱置于一个1.5 mL的新离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入50 μL Buffer GE， 室温放置2～5 min，8 000 r/min离心1 min,收集DNA溶液，-20℃保存。

2.2.4 热解-异硫氰酸胍联用法提取基因组DNA

取10 mL 2.1制备样品于离心管中，4℃，4 000 r/mim离心10 min，用棉签擦去管壁上的乳蛋白和乳脂，重复离心擦拭步骤三次。加入10 mLPBS重新悬浮，轻轻震荡，重复离心擦拭步骤一次。

分别取200 μL样品于1.5 mL Eppendorf管中，加入400 μL异硫氰酸胍裂解液，混匀，室温放置10 min，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，充分混匀，12 000 r/min离心10 min。取上清，加入0.8倍体积异丙醇，-20 ℃沉淀30 min，12 000 r/min离心10 min，弃上清，70%乙醇洗涤沉淀，室温干燥20 min，加入30 μL TE溶解，-20℃保存备用。

2.3 复式PCR反应及检测

20 μL反应体系中含10 μL 2×Taq PCR Master Mix，引物( 浓度为20 μmol/L)0.5 μL, 模板2 μL, 双蒸水至20 μL。 反应条件：95℃预变性3 min；94℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s；25个循环；72 ℃再延伸5 min。 取10 μL PCR 产物，2.0%琼脂糖凝胶110 V电泳40 min,凝胶成像系统记录结果。

3 实验结果

3.1 热解法提取结果

采用热解法提取样品中基因组DNA，结果经2.0%琼脂糖凝胶电泳，如图1中所示。由图1可以看出，泳道1在300 bp左右出现一条目的条带，由此可以证明已提取牛奶基因组；而泳道2、3、4号上均没有出现300 bp和433 bp目的条带，说明没有提取出相应的基因组，推测是大豆的存在干扰了牛奶基因组的检测。由此可见，该方法不适于对牛奶和大豆基因组DNA的提取。

图1 热解法凝胶电泳结果

3.2 异硫氰酸胍法提取结果

图2为异硫氰酸胍法扩增产物凝胶电泳结果。由图2中可以看出，大豆基因组提取效果良好，但牛奶基因组提取量不足，甚至无法检出。

3.3 试剂盒法提取结果

图3为试剂盒法扩增产物凝胶电泳结果。由图3可以看出，牛奶和大豆基因组均未提出，说明该方法不适用于提取牛奶和大豆基因组提取。

3.4 热解-异硫氰酸胍联用法提取结果

图4为热解-异硫氰酸胍联用法扩增产物凝胶电泳结果。由图4可以看出，该方法对牛奶和大豆的基因组提取效果都非常好，随着大豆浓度的递增各扩增带逐渐增强,检出限为3%豆浆掺入量，针对豆浆掺入量大于5%以上才能达到盈利的目的[8]，本方法可完全达到检测要求。

图2 异硫氰酸胍法电泳结果

图3 试剂盒法凝胶电泳结果

图4 热解-异硫氰酸胍联用法凝胶电泳结果

3.5 实际样品测定

用本方法对20份牛奶进行了检测，按2.2.4中方法操作，制备样品，在2.3条件下进样PCR，电泳。各样品中均未检出大豆源性物质，说明测定的20份牛奶品质较好。

4 讨 论

4.1 复式PCR方法的确定

复式PCR是在传统PCR基础上同时扩增两种DNA片段，能同时检测出两种物质的存在。复式PCR是对传统的PCR技术进行改进，建立并完善PCR步骤，通过正交试验设计，对退火温度、琼脂糖凝胶浓度和电泳电压3个因素进行3水平的优化，最终确定最佳的条件，进一步确定检测的可能性。因此，本实验建立的复式PCR检测系统，易于操作、稳定性好、准确性高、适于推广，可用于牛奶中掺杂大豆源性成分的检测。

4.2 牛奶与豆浆基因组提取效果

如图4中泳道3，4，5，6所示：433 bp处目的条带明显比300 bp产物含量高，表明该法提取大豆的基因组含量比牛奶高。分析这一现象的原因，主要是异硫氰酸胍的作用，相关文献表明异硫氰酸胍法主要是针对大豆基因组DNA提取的。因此，当使用该法同时提取牛奶和大豆基因组时，牛奶的基因组提取量要少于大豆的基因组提取量。

4.3 基因组提取方法的选择

本研究主要研究采用热解法、异硫氰酸胍法、基因组DNA提取试剂盒法及热解法-异硫氰酸胍联合法四种方法提取牛奶和大豆中基因组DNA，设计引物，通过复试PCR方法获取目的基因片段，比较四种方法对于牛奶中掺有大豆源提取基因组DNA的灵敏度。结果发现，热解法仅可提取少许牛奶基因组，异硫氰酸胍法则只能提取大豆基因组，而基因组DNA提取试剂盒法则没有提取出牛奶和大豆基因组。分析原因可能是牛奶和大豆是两种不同来源的蛋白质，大豆是属于植物源性蛋白；牛奶是属于动物源性蛋白，并且脂肪含量极高。热解法是针对动物源性蛋白提取的方法，异硫氰酸胍法无法去除乳蛋白和乳脂，针对这种情况，本研究采用热解法-异硫氰酸胍联合法，与其他三种方法比较，该法能够有效的提取牛奶及其掺杂的大豆源成分的基因组DNA，结果准确，方便操作。

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[6]RODRIGUES N P，GIVISIEZ P E，QUEIROGA R C.Milk adulteration:Detection of bovine milk in bulk goat milk produced by smallholders in northeastern Brazil by a duplex PCR assay[J].Journal of dairy science.2012,95(5):2749-2752.

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