大鼠弥漫性轴索损伤后突起坍塌蛋白Sema3A及其受体neuropilin-1的表达

安吉洋，宋锦宁，王军锋，庞宏刚，罗显华，周丽丽，孙 鹏，程毛峰

(1.郑州大学第一附属医院神经外科，河南郑州 450052；2. 西安交通大学医学院第一附属医院神经外科，陕西西安 710061；3. 西安交通大学医学院第二附属医院普通外科，陕西西安 710004)

◇专题研究◇

大鼠弥漫性轴索损伤后突起坍塌蛋白Sema3A及其受体neuropilin-1的表达

安吉洋1,2，宋锦宁2，王军锋2，庞宏刚2，罗显华2，周丽丽3，孙 鹏2，程毛峰2

(1.郑州大学第一附属医院神经外科，河南郑州 450052；2. 西安交通大学医学院第一附属医院神经外科，陕西西安 710061；3. 西安交通大学医学院第二附属医院普通外科，陕西西安 710004)

目的 研究突起坍塌蛋白(semaphorin 3A, Sema3A)及其受体神经纤毛蛋白1(neuropilin-1, NRP-1)在弥漫性轴索损伤(DAI)大鼠脑组织中的表达，探讨二者在DAI后脑损伤及神经修复中的可能作用及分子机制。方法 健康成年雄性SD大鼠48只，随机分为4组：对照组、DAI后6 h、24 h、7 d组，每组各12只。采用大鼠头颅瞬间旋转损伤装置，制作大鼠颅脑DAI模型，改良NSS法评估大鼠神经功能的改变。按预定时间点灌注取脑进行HE及镀银染色，免疫荧光染色检测Sema3A和NRP-1的表达定位。RT-PCR与Western blot分别检测皮质、海马、脑干Sema3A和NRP-1的mRNA及蛋白表达。结果 DAI造模后在脑干、皮髓交界区、胼胝体等部位观察到神经轴突有不同程度的肿胀、迂曲、断裂、轴索球形成等病理征象，并有不同程度的神经细胞变性、核固缩等改变，伤后24 h最明显。免疫荧光显示Sema3A主要表达于各脑区神经元，NRP-1表达于神经元、星形胶质细胞及微血管内皮细胞。对照组Sema3A和NRP-1 mRNA及蛋白表达水平较低，DAI后6 h其表达显著升高，24 h达高峰，并持续到7 d。结论 Sema3A及其受体NRP-1在DAI大鼠脑组织内表达升高，参与神经损伤及修复的病理生理过程。

弥漫性轴索损伤；突起坍塌蛋白；neuropilin-1；神经再生

弥漫性轴索损伤(diffuse axonal injury, DAI)为创伤性脑损伤的一种特殊类型，以脑内广泛发生的轴索变性、断裂、轴索回缩球形成为主要病理特征，造成严重的意识障碍，预后差，其发生发展及导致脑损伤的机制十分复杂，仍缺乏有效的治疗策略。Sema3A是神经系统发育过程中的一种抑制性轴突导向因子，与其受体NRP-1结合后，通过诱导轴突末端的生长锥坍塌崩解，促使轴突生长方向逆转，从而起到轴突的定向导航作用，参与神经纤维成束、分枝及突触形成等过程[1]。但是，Sema3A在成熟神经系统损伤与修复中发挥的作用尚未完全清楚。现有研究已涉及脑缺血及脊髓损伤等领域，而对DAI这一具有特征性的与轴突损伤密切相关的疾病却未见阐述。基于Sema3A的生理功能，Sema3A上调后可能参与轴索损伤后轴突网络的退缩、崩解，继而引起神经元死亡，并可能在脑损伤修复、神经再生和突触可塑性中起到抑制性作用[2]。因此，本研究通过在体检测DAI后Sema3A和NRP-1的表达及变化情况，初步探讨Sema3A及NRP-1参与DAI病理生理过程的相关机制，为后续实验研究及DAI的临床干预提供新的思路及靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物和主要试剂 相同遗传背景的健康成年雄性SD大鼠48只，体质量200～250 g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供(许可证号：SCXK(陕)2007-001)。按照随机数字表法分为对照组(12只)、DAI组(6 h、24 h、7 d组，各12只)。兔抗Sema3A(北京博奥森)，兔抗NRP-1(武汉博士德)，小鼠抗NeuN(美国Millipore)，小鼠抗GFAP(美国CST)，小鼠抗β-actin(美国Santa Cruz)，RNAiso Plus、PrimeScript RT Master Mix反转录试剂盒、PremixTaq®Version 2.0试剂盒购自宝生物工程大连有限公司，FITC标记的羊抗兔二抗及Cy3标记的羊抗小鼠二抗购自北京中杉金桥公司。

1.2 大鼠DAI模型的制作 DAI组采用自制的大鼠头颅瞬间旋转损伤装置建立模型[3-4]，具体如下：按照2.0 mL/kg的剂量用100 g/L水合氯醛大鼠腹腔注射进行麻醉。待麻醉稳定后将大鼠放在约20 cm厚的海绵垫上成俯卧位，通过门齿孔、头夹以及两个耳棒固定大鼠头颅，实验台面与大鼠躯干约30度夹角。将弹簧拧紧处于紧张位，此时两横杆处于水平位。因大鼠清醒状态下更能模拟真实的DAI损伤，因此将大鼠头颅固定后待其清醒，此时大鼠开始剧烈挣扎，于挣扎间歇期按下扳机，造成大鼠头颅瞬间旋转及制动，造成DAI损伤，重复打击8次。对照组麻醉固定后不予加速旋转处理，其他操作与DAI组相同。

1.3 组织病理学与免疫荧光染色 对照组(术后24 h取材)及DAI组取6只大鼠在预定的时间点深度麻醉后经左心室灌注生理盐水及40 g/L多聚甲醛预固定后迅速开颅取脑，取前囱后4 mm至8 mm间脑组织块，置40 g/L多聚甲醛溶液中后固定24 h，石蜡包埋后连续冠状切片，每个脑块8张，片厚5 μm，表于明胶处理过的载玻片，烤箱烘干，分取2张切片常规脱蜡、水化后用于HE染色、Gless-Marsland渡银染色、免疫荧光染色。免疫荧光双标方法检测Sema3A及NRP-1表达的细胞类型，神经元采用NeuN标记，星形胶质细胞采用GFAP标记。具体方法如下：切片脱蜡水化后，微波加热法修复抗原；山羊血清室温封闭30 min后，分别滴加兔抗Sema3A(1∶100)、兔抗NRP-1(1∶100)、小鼠抗NeuN(1∶200)、小鼠抗GFAP(1∶200)，4 ℃过夜；FITC标记的羊抗兔二抗或Cy3标记的羊抗小鼠二抗37 ℃避光孵育30 min后，DAPI室温孵育5 min，500 mL/L甘油封片；4 ℃避光保存，荧光显微镜下观察、分析、采集图像；Image-Pro Plus 6.0对免疫荧光染色结果进行分析。

1.4 RT-PCR检测Sema3A、NRP-1 mRNA的表达 每组6只大鼠麻醉满意后仰卧位固定于手术台上，左心室穿刺灌注生理盐水约100 mL，迅速断头取脑后置于4 ℃ 0.01 mol/L PBS中，仔细迅速分离出部分皮质、海马、脑干，置冻存管液氮中暂存。采用RNAiso Plus提取总RNA，取总RNA 500 ng，应用反转录试剂盒合成cDNA，RT反应条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 30 s。应用PremixTaq酶以1 μg cDNA为模板加入Sema3A、NRP-1及GAPDH上下游引物(Sema3A上游引物序列：5′-TGCTCCGACTTGCAGCATC-3′，下游引物序列：5′-CGCCTCTGAAATTGCCAATATACC-3′，产物长度143 bp；NRP-1上游引物序列：5′-GATTCCCTGAAGTTGGCCCT-3′，下游引物序列：5′-TCTCCTGGTGTCCACCCGTT-3′，产物长度310 bp；GAPDH上游引物序列：5′-TGGTGGACCTCATGGCCTAC-3′，下游引物序列：5′-CAGCAACTGAGGGCCTCTCT-3′，产物长度100 bp)，在25 μL体系中进行PCR扩增。PCR扩增条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，循环30次；72 ℃ 5 min。琼脂糖凝胶电泳确定反应产物，采用Gel Pro分析软件计算目的基因与内参GAPDH条带吸光度值的比值。

1.5 Western blot检测各分子蛋白表达 各组大鼠于预定时间点灌注取脑后另取一部分皮质、海马、脑干，立即用RIPA裂解液提取组织蛋白，以BSA为标准，用BCA法进行蛋白定量。取50 μg蛋白样品，SDS-PAGE电泳，半干法转移至PVDF膜(Millipore)，将膜放入50 g/L脱脂牛奶中37 ℃封闭1～2 h后，一抗(兔抗Sema3A，1∶400；兔抗NRP1，1∶500；小鼠抗β-actin，1∶1 000)4 ℃孵育过夜。TBST缓冲液洗膜后，将膜与辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶5 000)室温孵育1 h，洗膜后，用化学放光法观察显影，凝胶成像系统拍照后采用Quantity One软件测定条带吸光度做定量分析。

1.6 改良神经功能缺损评分(mNSS) 包括反射、运动、感觉及平衡等几方面的检查，最低0分，最高18分，分值越高，说明模型损伤越严重。0分正常，1～6 分说明大鼠神经功能轻度损害，7～12分说明大鼠神经功能中度损害，13～18分说明神经功能受到严重损害[3]。本研究将对照组及DAI各组大鼠在处死前采用随机盲法进行评分，每个时间点n=12。

2 结 果

2.1 DAI后神经功能缺损评分的比较 DAI组大鼠遭受打击后出现不同程度的昏迷。少部分大鼠昏迷程度较深，存在瞳孔反射迟钝或消失、羽翼反射、惊恐反射以及刺痛反射消失，翻倒后无翻正反应等，持续约45 min～2 h意识状态开始改善。昏迷程度较浅的表现为瞳孔反射减弱、痛觉刺激减弱、翻倒后能够自行翻正但反应减慢，持续约几分钟至几十分钟。所有大鼠清醒后均有行走不稳、反应迟钝、活动减少、平衡能力减弱等症状，可持续约数小时至数日。对照组大鼠清醒后感觉、反射及运动功能基本正常。DAI组与对照组神经功能缺损评分比较差异有统计学意义(表1)。

表1 各组大鼠mNSS评分的比较

Tab.1 Comparison of modified neurological severity scores in each group

(±s，n=12)

与对照组比较，*P<0.05。

2.2 DAI后脑组织病理形态学的改变 脑组织灌注取材后，大体观察可见对照组鼠脑无明显肿胀、出血等病理变化，DAI组脑肿胀明显，可见不同程度的蛛网膜下腔出血、点状出血灶，均无明显脑挫裂伤。HE染色后光镜观察可见对照组神经元及微血管形态结构完整，无微血栓形成，胶质细胞分布正常(图1A)。DAI组可见大量神经元核固缩变性、尼氏体溶解、部分微血管内微血栓形成、局部胶质细胞增生等病理改变(图1B)。镀银染色后镜下观察可见对照组神经纤维排列规则，无明显肿胀、屈曲及断裂，轴膜光滑平整(图1C)。DAI组可见神经纤维明显肿胀屈曲变形，部分神经纤维发生断裂，出现轴缩球，以24 h为重(图1D)。

2.3 DAI后各脑区Sema3A及NRP-1 mRNA表达的动态改变 DAI组皮质、海马、脑干Sema3A及NRP-1 mRNA表达于DAI后6 h开始增加，24 h达高峰，一直持续到7 d，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05，图2)。

2.4 DAI后大鼠脑Sema3A和NRP-1表达的组织与细胞定位 Sema3A及NRP-1在对照组阳性染色较少，DAI后二者阳性染色增多，主要分布于皮质、脑干、海马等部位。Sema3A阳性染色可见于神经元胞质和轴树突，以胞质为主，星形胶质细胞无明显表达(图3A、3B)。NRP-1阳性染色可见于神经元、星形胶质细胞、微血管内皮细胞，以胞膜及胞质为主(图3C、3D)。

图1 DAI后大鼠脑组织病理形态学的改变

Fig.1 Histopathological changes in brain sections after DAI

A：对照组HE染色；B：DAI(24 h)组HE染色；C：对照组镀银染色；D：DAI(24 h)组镀银染色，箭头所示为轴索迂曲断裂、呈串珠样改变、轴缩球形成。标尺=10 μm。

图2 大鼠DAI后皮质、海马、脑干中Sema3A和NRP-1 mRNA表达的改变

Fig.2 The time course of Sema3A and NRP-1 mRNA expressions in rat brain after DAI

A：琼脂糖凝胶电泳结果；B：半定量分析各组Sema3A和NRP-1在各脑区的mRNA表达，与对照组比较，*P<0.05，n=6。

2.5 DAI后各脑区Sema3A与NRP-1蛋白表达的定量分析 DAI组皮质、海马、脑干Sema3A及NRP-1表达于损伤后6 h开始增加，24 h达高峰，一直持续到7 d，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05，图4)。

3 讨 论

DAI动物模型包括瞬间旋转损伤模型、落体打击模型、液压冲击模型、可控皮质冲击模型等。其中较为符合DAI形成机制的是瞬间旋转损伤模型，其他模型均会造成一定程度的脑挫裂伤，对DAI病理生理机制的研究带来干扰。本研究采用自制改良的瞬间加速旋转装置制作DAI模型后，动物神经功能受损并出现不同程度的原发性昏迷，组织大体观察未见明显的脑挫裂伤，病理学观察可见大量神经元变性、部分微血管内微血栓形成、局部胶质细胞增生等改变，镀银染色可见神经纤维肿胀、屈曲变形、断裂、轴缩球出现等轴索损伤的典型表现，说明应用本装置制作出了良好的DAI模型，这是进行相关分子机制研究的基础。

图3 Sema3A和NRP-1在大鼠DAI后脑组织内表达的细胞定位

Fig.3 Immunohistochemical localization of Sema3A and NRP-1 on brain cross-sections after DAI (×200)

A：Sema3A表达于NeuN阳性神经元；B：Sema3A基本不表达于星形胶质细胞；C：NRP-1表达于NeuN阳性神经元；D：NRP-1表达于部分GFAP阳性星形胶质细胞。

图4 大鼠DAI后皮质、海马、脑干中Sema3A和NRP-1蛋白表达的改变

Fig.4 The dynamic expressions of Sema3A and NRP-1 in rat brain after DAI

A：免疫印迹结果；B：定量分析各组Sema3A和NRP-1在各脑区的蛋白表达，与对照组比较，*P<0.05，n=6。

Semaphorins是一类分泌性的信号分子家族，其家族成员均具有一个约500氨基酸构成的Sema结构域，基本功能是在神经发育中起轴突导向作用。Sema3A是目前研究最多、作用最强的分子，由Neuropilin-1和Plexin-1作为共受体，参与轴突导向、细胞迁移、肿瘤生长、血管生成、免疫调控等过程[2]。Sema3A及其受体在神经发育期高度表达，成年后表达下降，但在脊髓运动神经元、皮质和海马神经元仍有不同程度的表达[5]。成年后受损伤的脑组织具有一定发育脑的特征，Sema3A可能进一步表达上调参与脑损伤与修复的过程。既往研究表明，Sema3A在脑缺血后梗死灶及其周围[5-6]、脊髓损伤后瘢痕区及同侧大脑皮层[7-8]、皮质损伤后瘢痕中心及其周围[9]表达上调，并主要表达于神经元和瘢痕内成纤维细胞，其他细胞不表达，参与诱导神经元死亡、抑制轴突再生等过程。此外，Sema3A还可增加脑微血管内皮细胞通透性，可能通过加重血脑屏障损伤间接促进脑损伤[10]。

Neropilin-1为一跨膜受体，由于缺少胞质内信号转导结构域，需要Plexin A1作为共受体介导Sema3A的信号转导。此外，NRP-1还能与VEGF受体形成共受体介导VEGF的信号转导，参与轴突导向、血管生成等多种功能。既往研究表明，NRP-1在脑缺血[5-6,11-12]、脊髓损伤[7,13]中均有表达上调，并定位于神经元、胶质细胞、血管内皮细胞等多种细胞类型。脑缺血研究中发现，NRP-l的表达可由凋亡相关的转录因子E2F1调控[14]，下游则可能通过与胞质酪氨酸激酶Fer的直接相互作用，介导Sema3A诱导的神经元死亡[15]。研究还发现NRP-1与Fer激酶、Sema3A的下游信号分子坍塌素反应介导蛋白(collapsin response mediator protein, CRMP)共定位于膜筏，为相关分子机制提供了结构上的支持[16]。

以往的研究多数表明，Sema3A分子表达的升高对脑组织损伤起到促进作用，但是分子机制尚不完全清楚。Sema3A分子可以通过多种下游效应蛋白和细胞内通路对脑损伤起到促进作用。例如，它可以通过NRP-1、CRMP2与Fer激酶的相互作用介导脑缺血后神经元死亡[15,17]；通过降低丝氨酸磷酸酶PP2A的活性，破坏其与细胞间连接蛋白VE-cadherin的相互作用，促进血管通透性增高[10]；通过12/15-脂肪氧化酶抑制神经元轴突延伸及内皮细胞管形成发挥促进脑损伤和抑制修复的双重作用[18]；通过上调cGMP/PKG和下调cAMP/PKA依赖的LKB1和GSK3-β磷酸化从而抑制轴突生长、促进树突生长，诱导神经元极化与轴突收缩[19]；在成年海马通过激活Cdk5-FAK促进树突生长与分支参与神经再生[20]。但是，由于Sema3A的受体NRP-1表达的广泛性及作用的多重性，既往研究中发现Sema3A也可能发挥另一方面的作用。如应激神经元分泌的Sema3A可以通过作用于活化的小胶质细胞表达的NRP-1/Plexin A1促进其凋亡发挥对自身的保护作用[21]。而NRP-1也可介导VEGF的作用抑制血管内皮细胞凋亡，并可能在脑缺血后血管再生中发挥调控作用[11,22]。

本研究中，各组大鼠DAI后，从6 h开始，Sema3A及其受体NRP-l的基因及蛋白表达水平在各脑区均有显著增高。二者的表达高峰均出现在造模后24 h，此时正是脑组织早期损伤的高峰期而缓慢的恢复期未开始。因此，Sema3A及其受体的大量表达可能主要对损伤起到促进作用。例如，通过诱导轴突收缩加重轴索损伤，调控下游信号通路促进神经元死亡，加重血脑屏障损伤等。而在DAI后第7天，二者的表达仍高于对照组，且以NRP-1更明显，表明处于修复期时，二者发挥的作用可能有所转变。此时，Sema3A的上调主要发挥抑制神经再生与修复的作用，而NRP-1作为VEGF的受体之一可能开始介导促进血管再生的修复机制，其作用大小需取决于Sema3A与VEGF的竞争。本研究免疫组化结果显示，Sema3A主要定位于神经元胞质，而在星形胶质细胞无明显表达，其受体NRP-1的阳性表达则可见于神经元、胶质细胞、血管内皮细胞等，并以胞膜和胞质为主，这与其他脑损伤中的研究一致。但是，由于DAI并未造成明显的脑挫裂伤等损害，没有局灶性的脑梗死及瘢痕形成等继发性改变。因此，本研究未对Sema3A及NRP-1表达的另一个重要来源——脑膜成纤维细胞进行检测，推测其并无特异性表达。此外，DAI后脑损伤较重的区域为脑干、海马等中线结构，而海马还与神经再生密切相关。本研究中Sema3A及NRP-1的表达主要位于脑干核团、海马、皮质等神经元聚集的区域，而在皮质及脊髓损伤、脑缺血中二者表达则主要位于损伤或梗死区及其周围。在不同疾病中分子表达的差异，可能与损伤的类型有关。

基于当前的研究进展，针对Sema3A/NRP-1可选择的干预方式包括：相关抑制剂如SICHI[23]、NRP-1抑制肽[14-15]、decrorin[9]，基因调控，上游干预(如调控转录因子E2F1)和下游干预(如调控Fer激酶及其他信号通路)等。本研究尚未进行相关干预的研究，但为后续干预研究打下了良好的理论基础。

总之，本研究显示Sema3A及其受体NRP-1在大鼠DAI后早期脑组织内表达上调，可能在轴索损伤后发挥诱导神经元轴突收缩乃至死亡、抑制轴突再生的作用，并有可能参与血脑屏障损伤、神经血管再生等多个病理生理过程。但是，其中的具体机制仍有待进一步研究，而且在脑损伤急性期及慢性修复期Sema3A/NRP-1可能具有不同的生物学功能，急性期以加重脑损伤为主，慢性期则以抑制脑修复为主，涉及细胞死亡、神经血管再生、瘢痕形成等多种过程。进一步阐明相关分子机制，并在脑损伤的不同时期辩证制宜地采取不同的干预策略，可能为DAI后减轻脑损伤、促进神经修复提供新的思路与方向。

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(编辑 韩维栋)

Expressions of semaphorin 3A and neuropilin-1 in the brainafter diffuse axonal injury in rats

AN Ji-yang1,2, SONG Jin-ning2, WANG Jun-feng2, Pang Hong-gang2,LUO Xian-hua2, ZHOU Li-li3, SUN Peng2, CHENG Mao-feng2

(1. Department of Neurosurgery, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450052; 2. Department of Neurosurgery, the First Affiliated Hospital,Medical School of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061; 3. Department ofGeneral Surgery, the Second Affiliated Hospital, Medical School ofXi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, China)

Objective To investigate the spatial and temporal expressions of semaphorin 3A (Sema3A) and its receptor neuropilin-1 (NRP-1) in the rat brain after diffuse axonal injury (DAI) and to explore the role of Sema3A and NRP-1 in the pathophysiological mechanisms of DAI. Methods A total of 48 healthy adult male rats were divided into four groups (n=12 in each): control, 6 h, 24 h and 7 d post-DAI. DAI model was established by an instant acceleration head rotating device. The modified neurological severity scoring was performed. HE and silver staining were used to detect the histopathological changes in the brain after DAI. Fluorescence immunohistochemistry was used to detect the spatial expressions of Sema3A and NRP-1. The expression levels of Sema3A and NRP-1 in the cerebral cortex, hippoampus, and brain stem of rats after DAI were determined with RT-PCR and Western blot, respectively. Results After DAI modeling, swollen axons, axonal axotomy and axonal retraction balls were observed in the brain stem, cortex, corpus callosum, and other brain regions. Varying degrees of karyopyknosis of neurons, swelling of microvascular endothelial cells, and microthrombosis were also observed. These changes were the most severe at 24 h after injury. Immunohistochemistry showed that Sema3A was mainly expressed in neurons and that NRP-1 was expressed in neurons, astrocytes and endothelial cells. In comparison with those in control group, the mRNA and protein levels of Sema3A and NRP-1 were upregulated in the cortex, hippocampus and brain stem after DAI, and peaked at 24 h, and lasted until 7 d. Conclusion Sema3A and NRP-1 are upregulated and involved in the pathophysiological mechanism of brain injury after DAI. Under pathological conditions such as axonal injury, the expression of Sema3A in neurons may act to suppress axonal growth and induce neuronal apoptosis.

diffuse axonal injury; semaphorin 3A; neuropilin-1; neural regeneration

2014-04-21

2014-06-27

国家自然科学基金资助项目(No.30471774)；教育部新世纪优秀人才支持计划资助项目(No.NCET-05-0831)；陕西省自然科学基金资助项目(No.2003C1-16) Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.30471774),the New-Century Excellent Talents Program of Ministry of Education (No.NCET-05-0831) and the Natural Science Foundation of Shaanxi Province (No.2003C1-16)

宋锦宁，博士，教授，主任医师，博士生导师. E-mail: jinnings@126.com

安吉洋(1984-)，男(汉族)，博士. 研究方向：脑血管病、颅脑损伤的基础与临床. E-mail: anjiyang@163.com

时间：2014-09-19 08∶58 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140919.0858.001.html

R651.1

A

10.7652/jdyxb201406006