青岛市售双壳贝类大肠菌群/大肠杆菌检出水平与当地气温的相关性

武 娟，张 祺，李 丹，曹斌斌，左 涛，薛长湖，唐庆娟，*

（1.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛 266003;2.根特大学食品质量与安全系，比利时根特 9000）

双壳贝类是一种非选择滤食性生物，在生长过程中易积累和富集环境中的微生物。传统的加热烹调方法能够有效地灭活贝类中的微生物，但随着生鲜即食食品尤其是贝类等生食海产品的普及，贝类产品的安全卫生质量问题越来越受到人们的重视。

大肠杆菌是人及各种动物肠道中正常菌群，食品中检出大肠杆菌意味着食品已经被肠道排泄物污染。大肠杆菌作为各种食品的粪源性污染卫生细菌学指标，是国际上公认的卫生检测指示菌［1］。传统的微生物检测方法有国家标准 GB4789.3、行业标准SN0169－92等标准，但整个检测过程所需时间较长，费时费力，容易造成食品的积压、影响食品的品质［2］。3M PetrifilmTM测试纸片法检测大肠菌群和大肠杆菌，具有快捷、准确等优点，检测结果与传统方法相比在统计学上无显著性差异，其可靠性得到国际化认可［3－6］。

气温波动对贝类中微生物的生长繁殖具有重要影响，将影响贝类产品的品质、改变其货架期。在特定的温度变化范围内，大肠菌群/大肠杆菌随着温度的升高生长繁殖速度加快，即与气温变化呈正相关关系［7］。本研究拟采用3M PetrifilmTM测试纸片法，检测青岛市场上三种常见双壳贝类的大肠菌群/大肠杆菌水平，并且采用斯皮尔曼等级相关系数，进一步分析其与当地气温变化的相关性。本研究成果将对贝类产品加工储运及其卫生质量控制起到一定指导作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜的牡蛎、毛蚶、海虹三种双壳贝类产品 购于青岛市农贸市场;PBS袋装预混试剂（10mM，pH7.2） 北京康为世纪生物科技有限公司;3M PetrifilmTM大肠菌群/大肠杆菌测试片 美国3M公司;电热恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司;九阳料理机JYL－C012 九阳股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理 自2012年10月至2013年3月，牡蛎、毛蚶、海虹三种双壳贝类样品每周采购一次，每种样品采购20个。无菌开壳收集贝类肉，各称取贝类肉10g分别于无菌的90mL PBS中均质，取1mL均质上清液分别加到9mL PBS中，每种贝类肉作两个平行测试。每周共6个（3×2）测试样品，6个月总共测试144个（6×4×6）样品。

1.2.2 实验方法 具体操作步骤参照文献［8］:将PetrifilmTM大肠菌群/大肠杆菌测试片置于平坦实验台面，揭开上层膜，用吸管吸取1mL PBS稀释样液滴加在测试片的中央，将上层膜缓慢盖下。把压板放置在上层膜中央轻轻地压下，使样液均匀覆盖于圆形的培养面积上。静置1min使培养基凝固。将测试片的透明面朝上，水平置于电热恒温培养箱内，培养温度为（36±1）℃。培养24h后，计数红色和蓝色带有气泡的菌落数为大肠菌群数cfu/g，计数蓝色带有气泡的菌落数为大肠杆菌数cfu/g。

当地周平均气温根据青岛天气预报查询网站tianqi.2345.com查询后，计算统计周平均气温。

1.2.3 相关性统计方法 以查尔斯·斯皮尔曼命名的斯皮尔曼等级相关系数，用希腊字母ρ（rho）或者rs表示。它是衡量两个变量依赖性的非参数指标，利用单调方程评价两个统计变量的相关性，如果数据中没有重复值，并且当两个变量完全单调相关时，斯皮尔曼相关系数则为+1或－1［9］。本文采用斯皮尔曼等级相关系数评价大肠杆菌/大肠菌群与周平均气温变化的相关性，计算公式如下:

n为等级个数，d为二列成对变量的等级差数。

2 结果与分析

2.1 三种贝类样品中的大肠菌群检出水平及与周平均气温变化的相关性

本研究中每10g贝类样品以PBS稀释1000倍后进行检测，根据3M PetrifilmTM测试法检出限为1cfu/mL，可以推算出:本研究大肠菌群/大肠杆菌的最低检测限为100cfu/g。若2个平行样品之一检测结果为阴性，另一个为100cfu/g，则出现表1中所示的50cfu/g。由表1可知，牡蛎、毛蚶和海虹三种贝类样品中高水平的大肠菌群检出集中在检测期内（2012年10月份）的前3个周，最高水平达到106，从第9周往后，大肠菌群的检出水平开始降低。为了进一步评价大肠菌群检出水平与周平均气温变化的关系，我们将当地周平均气温变化进行了统计，并与每周三种样品中大肠菌群检出平均水平做出关系图（如图1所示）。结果显示，在本研究检测期内周平均气温相对较高的前几周，大肠菌群的检出水平相对较高;随着气温降低，大肠菌群的检出水平也随之降低。经斯皮尔曼等级相关性分析可知，当地周平均气温与贝类大肠菌群检出水平具有高度的正相关性（ρ=0.712）。

表1 PF法检测贝类中大肠菌群结果（单位:cfu/g）Table 1 Result of PF method for detection of Coliform in shellfish（unit:cfu/g）

2.2 三种贝类样品中的大肠杆菌检出水平及与周平均气温变化的相关性

由表2可知，48份牡蛎样品中第2周的两份平行样品均检测出大肠杆菌阳性，平均水平为700cfu/g，毛蚶样品中第1周的两份平行样品均检测出阳性，平均水平为1100cfu/g，第3、17、21、24 周的两份样品中只有一份检测出阳性结果，平均水平为50cfu/g，海虹样品中第2、7、9、10周的两份样品中只有一份检测出阳性结果，平均水平为50cfu/g。为了进一步评价大肠杆菌检出水平与周平均气温变化的关系，我们将周平均气温与每周的三种样品大肠杆菌检出平均水平做出关系图（如图2所示）。结果显示在检出大肠杆菌的12份阳性样品中有9份集中在前10周周平均气温比较高的月份，而且经过相对较低的气温后（第12～20周），从第21周开始气温有所回升，大肠杆菌亦重新检出。经斯皮尔曼等级相关性分析，周平均气温与大肠杆菌检出水平亦有一定的正相关关系（ρ=0.481）。

图1 大肠菌群与周平均气温变化的相关性Fig.1 The correlation between coliforms and average temperature changes per week

表2 PF法检测贝类中大肠杆菌结果（单位:cfu/g）Table 2 Result of PF method for detection of E.coli in shellfish（unit:cfu/g）

图2 大肠杆菌与周平均气温变化的相关性Fig.2 The correlation between E.coli and average temperature changes per week

上述结果提示:在当地气温较高时，贝类受到大肠菌群和大肠杆菌污染情况比较严重，需对贝类产品的贮藏运输及质量控制予以高度重视。

2.3 三种贝类污染大肠菌群/大肠杆菌情况比较

为了分析比较三种贝类污染大肠菌群/大肠杆菌的情况，我们将大肠菌群/大肠杆菌检出水平按月份进行了统计（如图3）。在检测期内，三种贝类中大肠菌群检出水平以2012年10月份最高，平均水平分别为258025、261988、3800cfu/g，11 月份检出平均水平分别为 2475、925、1713cfu/g，11 月份之后检出水平逐渐降低。大肠杆菌检出水平也是10月份最高，2013年1月份三种样品大肠杆菌检出水平均为0cfu/g。牡蛎中大肠杆菌检出率最低（5%），但是检出水平较高（平均水平为175cfu/g），发生在检测期内温度最高的10月份;毛蚶中大肠杆菌检出率最高（13%），是三种贝类中最易受大肠杆菌感染的贝类，检出水平最高达到288cfu/g。

图3 大肠菌群/大肠杆菌检出按月份分析比较Fig.3 Analysis and comparison of coliform/E.coli detection according to the month

2.4 三种贝类半年内大肠菌群/大肠杆菌检出分析比较

通过分析比较从2012年10月到2013年3月半年内三种贝类中大肠菌群/大肠杆菌检出平均水平及检出率，发现牡蛎中大肠菌群和大肠杆菌检出率是三种样品中最低的;毛蚶中大肠菌群和大肠杆菌检出平均水平及检出率在三种贝类中均为最高;海虹中大肠菌群和大肠杆菌平均检出水平比其余两种贝类低，但其检出率却相对较高（见表3）。上述结果提示，牡蛎相对于毛蚶和海虹而言不易染菌，一旦感染，则检出水平较高;毛蚶在三种样品中最易染菌，而且检出水平很高;海虹相对于其它两种贝类大肠菌群和大肠杆菌检出水平最低。

表3 半年内大肠菌群/大肠杆菌检出分析比较Table 3 Analysis and comparison of coliform/E.coli detection within half a year

3 结论与讨论

大肠杆菌作为各种食品的粪源性污染细菌学指标，是国际上公认的卫生检测指示菌。本研究采用3M PetrifilmTM测试纸片法，快速检测青岛市售三种常见双壳贝类的大肠杆菌/大肠菌群水平，并用斯皮尔曼等级相关系数评价大肠菌群/大肠杆菌与当地气温变化的相关性。结果显示，在我们检测期内周平均气温相对较高的前几周，大肠菌群/大肠杆菌的检出水平也相对较高，随着气温的降低，大肠菌群/大肠杆菌的检出水平也随之降低。研究结果表明，青岛市售双壳贝类中大肠菌群/大肠杆菌的检出具有温度依赖性，其检出水平与当地气温变化呈一定的正相关关系，斯皮尔曼等级相关系数分别为ρ=0.481、ρ=0.712。本研究提示:在当地气温较高时，贝类受到大肠菌群和大肠杆菌污染情况比较严重，需对贝类产品的贮藏运输及质量控制予以高度重视。

控制环境温度以延长贝类产品的货架期，进行有效的保活保鲜，是满足人类的需求以及控制食品安全的必要条件，也是将其打入海外市场的关键所在。浙江省采用海水激冷、冷藏仓空气冷却、喷雾加湿、蓄冷保湿等先进的低温保鲜技术，而达到无冰保鲜，具有广阔的应用前景［10］，泥蚶经处理后，细菌繁殖、生长代谢速度变慢，菌落总数也处于较低状态，可以维持较长的货架期。高捷［11］对毛蚶的保鲜技术进行研究，采用生物保鲜剂，考察不同温度对毛蚶保鲜效果的影响，结果表明:采用生物保鲜剂处理结合低温贮藏能较好地保持毛蚶的品质和鲜度。因此，低温环境可以控制细菌繁殖，避免储藏运输过程中贝类腐败变质，延长贝类产品的货架期。

蔡友［12］等曾对浙江、江苏、福建和山东青岛等地沿海贝类主要产区的微生物污染情况进行调查。调查结果和有关资料显示，青岛市近岸海水中大肠菌群超标率为26%，贝类体内大肠菌群超标率为90%;福建的大肠杆菌超标率也较高，而江苏、浙江相对好一些。在调查中，青岛的细菌总数一般在104～106之间，而浙江、福建、江苏好得多，一般在104左右。国家和农业部已采取措施将贝类健康化养殖体系示范列入农业跨越计划，福建、青岛都相继开展贝类净化工程，有效去除贝类的泥沙、微生物和病毒等，在治理餐桌污染上取得了一定的成效。经过净化，高效消灭贝类产品中的病原菌和各种病毒，如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、甲肝病毒、流感病毒等。净化后的贝类既保存了原有的美味和营养，又达到食用标准，甚至可以生吃［13］。

大量研究发现，潮汐、海水温度、盐度、流速、饵料的浓度和质量和贝类个体大小等都会影响贝类的摄食（滤水）速率［14］。温度、盐度、流速和饵料对贝类摄食速率的影响特征都呈单峰变化（即在最适的温、盐度和饵料供应条件下摄食率最大）;海洋贝类在低盐度下会逐渐停止摄食并关闭贝壳以避免低渗对肌体的损害。贝类个体大小对摄食速率有显著影响，用壳长或体重表述贝类个体大小对摄食速率的影响是可行的。此外，对不同环境的适应、遗传特性，以及摄食器官的形态构造特点等也影响贝类的摄食行为。林元烧［15］等在实验室条件下对厦门海域4种养殖贝类，僧帽牡蛎、菲律宾蛤仔、缢蛏和翡翠贻贝的滤水率进行研究，发现滤水率大小顺序依次为僧帽牡蛎、缢蛏、翡翠贻贝、菲律宾蛤仔。因此，海水的温度等环境条件及贝类个体的自身差异都会影响其滤水率和摄食行为。本研究结果显示:青岛市售三种常见贝类中，牡蛎相对于毛蚶和海虹而言不易染菌，一旦感染，则检出水平较高;毛蚶在三种样品中最易染菌，而且检出水平高;海虹相对于其它两种贝类大肠菌群和大肠杆菌检出水平最低。该结果可能与三种贝类滤水率和摄食行为不同有关。

本研究只收集了半年的贝类样品，涉及到青岛市三种常见贝类，要全面评价贝类中大肠杆菌、大肠菌群与当地气温变化的相关性，还需要对其它季节及更多贝类进行深入的研究。

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