不同香型白酒中游离氨基酸比较分析

张庄英，范文来，徐 岩

（教育部工业生物技术重点实验室，江南大学生物工程学院酿酒科学与酶技术研究中心，酿造微生物与应用酶学研究室，江苏无锡 214122）

饮料酒中的氨基酸主要来源于酿酒原料中蛋白质的酶降解，发酵过程中微生物的代谢产物和发酵完毕后微生物细胞的自溶［1－4］。研究发现，氨基酸对葡萄酒品质有重要影响［1］，是黄酒重要的营养成分和风味前驱体［5－6］，白酒中氨基酸可能对白酒的口味有影响［7］。饮料酒中的杂醇油主要来自于发酵过程中氨基酸的脱氨基和脱羰基代谢，如正丙醇来源于苏氨酸、异丁醇来源于缬氨酸、异戊醇来源于亮氨酸，2－苯乙醇来源于苯丙氨酸等［4，8］。此外，在饮料酒的发酵过程中，氨基酸还与多种含氮化合物的形成相关。研究发现，吡嗪类化合物是白酒的重要香气成分［9－10］，吡嗪的杂环氮原子来自α－氨基酸［11］;白酒中氨基甲酸乙酯（EC，Ethyl Carbamate，一种2A类致癌物）和生物胺也与氨基酸含量有很大关系［12－13］。

国内外对饮料酒氨基酸对产品质量的影响已有较多研究［3，5，14－15］，但对我国白酒氨基酸的研究比较少。Fancisco等人［3］曾测定朗姆酒、威士忌和巴西甘蔗酒中的游离氨基酸，发现脯氨酸含量最高，代表性的氨基酸还有天冬氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、精氨酸、酪氨酸和赖氨酸。朗姆酒和威士忌酒中 氨 基 酸 含 量 分 别 为 1.09 ～ 5.53mg/L、0.61 ～10.44mg/L，高于巴西甘蔗酒（0.68～5.59mg/L）。经单因素方差分析，巴西甘蔗酒与朗姆酒中丝氨酸、丙氨酸、精氨酸、苯丙氨酸和半胱氨酸的含量有显著差异，巴西甘蔗酒与威士忌中丙氨酸、精氨酸、酪氨酸和异亮氨酸的含量有显著性差异;威士忌与朗姆酒中谷氨酰胺和脯氨酸的含量有显著性差异。国内早期曾检测过杜康酒的氨基酸，在杜康调味酒中检测到苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、赖氨酸和组氨酸，成品酒中检测到苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸和赖氨酸。

鉴于氨基酸的重要性且国内外对白酒的氨基酸组成缺乏研究，本文旨在比较分析不同香型的白酒原酒和成品酒的游离氨基酸组成，进而为揭示白酒发酵、蒸馏和贮藏过程中含氮化合物的变化提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酱香型 郎酒原酒（52.3～57.2%vol）、成品酒（39.2～53.8%vol） 四川郎酒集团有限责任公司提供;习酒原酒（51.7%vol）、成品酒（53%vol） 贵州茅台酒厂（集团）习酒有限责任公司提供;浓香型 洋河大曲原酒（63.2～73.3%vol）、成品酒（55%vol） 江苏洋河酒厂股份有限公司提供;习酒原酒（65.79%vol）、成品酒（52.9%vol） 贵州茅台酒厂（集团）习酒有限责任公司提供;清香型 汾酒原酒（44.0～46.0%vol）、成品酒（63～67%vol） 汾酒集团提供;宝丰酒原酒（78.2%vol）、成品酒（52%vol） 宝丰酒业有限公司提供;凤香型 西凤原酒（45.0～55.0%vol）、成品酒（45～65%vol） 陕西西风股份有限公司提供;兼香型 口子窖原酒（61.8～67.8%vol）、成品酒（52～55%vol） 安徽口子酒业股份有限公司提供;药香型 董酒原酒（60～62%vol）、成品酒（46～54%vol） 贵州遵义董酒厂提供;豉香型 米香基酒（52.2%vol）成品酒粤宴酒 （45.0%vol）、乡醇酒（28.0%vol）、九江双蒸酒（29.5%vol）、九江双蒸浸泡酒（53.0%vol） 广东省九江酒厂有限公司提供;老白干香型 老白干原酒（58～66.5%vol） 河北衡水老白干酿酒（集团）有限公司提供;谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）、瓜氨酸（Cit）、苏氨酸（Thr）、甘氨酸（Gly）、精氨酸（Arg）、丝氨酸（Ser）、蛋氨酸（Met）、亮氨酸（Leu）、脯氨酸（Pro）、异亮氨酸（Ile）、丙氨酸（Ala）、酪氨酸（Tyr）、半胱氨酸（Cys）、缬氨酸（Val）、组氨酸（His）、苯丙氨酸（Phe）、赖氨酸（Lys）、邻苯二甲醛（OPA，o－phthalaldehyde）、9－芴基甲氧基羰酰氯（FMOC，9－fluorenylmethylchloroformate）、三乙胺 美国西格玛公司，色谱纯;结晶乙酸钠、醋酸、甲醇、乙腈、四氢呋喃 上海安谱科学仪器有限公司，色谱纯;三氯乙酸（TCA，trichloroacetic acid） 国药集团化学试剂有限公司，分析纯。

安捷伦液相色谱仪1100配有柱温箱、自动进样器、四元梯度泵和紫外检测器 美国安捷伦公司;色谱柱 ODS HYPERSIL 250mm ×4.6mm ×5μm 美国默赛飞世尔科技;台式离心机TGL－16G 上海安亭科技仪器厂;纯水仪Millipore Simplicity UV 美国密理博公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理 准确吸取1mL酒样于5mL离心管中，加入 1mL 10%TCA溶液，振荡 1min。于10000r/min离心15min，经0.45μm水相滤膜过滤后，取500μL于样品瓶中，待进样。

1.2.2 高效液相色谱定量方法 氨基酸的定性定量方法:以保留时间定性，采用峰面积外标法定量。色谱条件:分析方法为OPA FMOC柱前衍生化［16］，ODS HYPERSIL 色谱柱（250mm ×4.6mm ×5μm），柱温为40℃，检测波长为338nm，进样量10μL。流动相A:称取 8.0g结晶乙酸钠于 1000mL烧杯中，加入1000mL水搅拌至所有结晶溶解，再加入225μL三乙胺，搅拌并滴加5%的醋酸，将 pH 调到7.20±0.05;加入5mL四氢呋喃，混合后用0.45μm的水相微孔滤膜过滤，备用。流动相B:称取8.0g结晶乙酸钠于1000mL烧杯中;加入400mL搅拌至所有结晶溶解;滴加2%醋酸将pH调到7.20±0.05;将此溶液加入到800mL乙腈和800mL甲醇混合液中，混合均匀后，用0.45μm的有机微孔滤膜过滤，备用。

氨基酸测定的洗脱程序见表1。

表1 氨基酸的高效液相色谱洗脱梯度Table 1 The elution gradient of high－performance liquid chromatography for amino acid

1.2.3 单因素方差分析 使用SPSS20软件对数据进行单因素方差分析。

2 结果与讨论

2.1 不同香型原酒游离氨基酸的比较分析

2.1.1 不同香型原酒中游离氨基酸的定性定量 白酒原酒中 18 种游离氨基酸总量 12.19～131.14mg/L，其中91.49%的样品中的游离氨基酸总量为12.19～29.41mg/L。不同香型原酒的游离氨基酸总量差异较大，浓香型原酒远高于其他香型，凤香型和老白干香型仅次于浓香型，豉香型含量最低;但同种香型不同白酒样品的氨基酸总量差异不大（见表2）。

检测到原酒中18种游离氨基酸是谷氨酸、天冬氨酸、瓜氨酸、苏氨酸、甘氨酸、精氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、组氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸。由表3可知，脂肪族氨基酸（谷氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、甘氨酸、精氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸和赖氨酸）占游离氨基酸总量的 76.00%（老白干香型）～87.37（凤香型），其中酸性氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）含量最高，约占氨基酸总量的 28.73%（浓香型）～56.20%（药香型）;其次是中性氨基酸（甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸），约占 3.85%（药香型）～39.17%（浓香型）;羟基氨基酸（丝氨酸、苏氨酸）约占氨基酸总量的10.12%（浓香型）～29.28%（豉香型）;另外，碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸）约占 0.10%（豉香型）～7.12%（老白干香型）;含硫氨基酸（蛋氨酸、半胱氨酸）约占0.12%（豉香型）～1.70%（浓香型）。芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸）约占 0.00%（豉香型）～6.8%（老白干香型）。杂环氨基酸（脯氨酸、组氨酸）约占0.00%（老白干香型）～4.99%（凤香型）。由此可知，药香型原酒酸性氨基酸含量最高，中性氨基酸含量最低;浓香型原酒中性和含硫氨基酸含量最高，酸性和羟基氨基酸含量最低;老白干香型原酒碱性和芳香族氨基酸含量最高，杂环氨基酸含量最低;豉香型原酒羟基氨基酸含量最高，碱性、含硫和芳香族氨基酸含量最低。

表2 不同香型原酒的游离氨基酸总量Table 2 The total free amino acid content in different aroma type Chinese base liquors

不同香型原酒游离氨基酸种类有差异（见表4）:酱香型和浓香型氨基酸种类最多（均检测到17种），其次为兼香型（16种）和清香型（15种），豉香型氨基酸种类最少（12种）。在酱香和浓香型原酒中检测到缬氨酸，但在其它6种香型中均未检测到。

不同香型原酒同一种氨基酸含量差异不同:谷氨酸、天冬氨酸、瓜氨酸、苏氨酸、甘氨酸、精氨酸、缬氨酸、组氨酸和脯氨酸在不同香型原酒中含量差异不大，其中谷氨酸、天冬氨酸、瓜氨酸、苏氨酸和甘氨酸含量均较高，占氨基酸总量的55.91%～95.54%;其它氨基酸在不同香型原酒中含量差异较大（见表4）。

2.1.2 不同香型原酒游离氨基酸的单因素方差分析基于不同香型原酒游离氨基酸种类和含量的差异，对8个香型的原酒进行单因素方差分析（见表4），结果表明:老白干香、酱香和浓香型原酒的氨基酸组成与其它香型差异显著，其中老白干香型的谷氨酸、天冬氨酸、瓜氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和异亮氨酸与其它香型差异显著，酱香型原酒的天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸和缬氨酸与其它香型差异显著，浓香型的天冬氨酸、苏氨酸和丝氨酸与其它香型差异显著;就氨基酸而言，不同香型原酒中的谷氨酸、天冬氨酸、瓜氨酸、苏氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、脯氨酸和甘氨酸差异显著。

2.2 不同香型成品酒游离氨基酸的比较分析

2.2.1 不同香型成品酒中游离氨基酸的定性定量白酒成品酒游离氨基酸总量 13.66～34.01mg/L，高于威士忌（0.61～10.45mg/L）、朗姆酒（1.09～ 5.53mg/L）和巴西甘蔗酒（0.68～5.59mg/L）［3］，但较葡萄酒（500～1000mg/L）［17］和黄酒（3000～ 10000mg/L）［5］低。从表5可知不同香型原酒游离氨基酸总量有差异，浓香型氨基酸总量最高，清香型和豉香型仅次于浓香型，兼香型含量最低。

表5 不同香型成品酒的游离氨基酸总量Table 5 The total free amino acid content in different aroma type Chinese final liquors

白酒发酵时酒醅中的氨基酸可经脱氨基和脱羧基代谢生成正丙醇、异丁醇、异戊醇和2－苯乙醇等杂醇油［11］，适宜的杂醇油含量及杂醇油之间的比例协调可使酒的口感柔和、协调，酒体丰满圆润，味道独特，但含量过高则会影响酒的口感且对人体有害［18］。研究表明，药香型成品酒中杂醇油含量较高（3852.26mg/L）［19］，其次是酱香型（1299.72mg/L）［20］、凤香型（1233.91mg/L）［21］、老白干香型（1204.81mg/L）［21］、浓香型（1033.54mg/L）［22］、兼香型（568.23mg/L）［23］，清香型（505.35mg/L）［21］酒中杂醇油含量最低。分析表 5知杂醇油含量较低的清香型成品酒游离氨基酸总量较高，而杂醇油含量较高的药香和酱香型酒中游离氨基酸总含量较低，由此可知白酒中的杂醇油含量与氨基酸含量呈现一定的负相关性。

表4 不同香型原酒游离氨基酸含量Table 4 The content of free amino acid in different aroma type Chinese base liquors

表6 白酒成品酒中不同种类的游离氨基酸占游离氨基酸总量的比例（%）Table 6 The distribution of different kinds of free amino acid in Chinese final liquors（%）

成品酒的18种游离氨基酸中脂肪族氨基酸含量最高（见表6），占游离氨基酸总量的83.66%（酱香型）～89.12（凤香型），其中含量最高的是酸性氨基酸，约占氨基酸总量的 44.65%（浓香型）～57.87%（清香型）;其次是羟基氨基酸，占13.29%（酱香型）～28.84%（兼香型）;中性氨基酸占 10.06%（凤香型）～18.90%（酱香型）;另外，含硫氨基酸占 0.06%（凤香型）～4.26%（浓香型）;碱性氨基酸占 1.17%（清香型）～3.83%（老白干香型）。芳香族氨基酸含量较低，占游离氨基酸总量的0.00%（清香型、凤香型、豉香型）～4.64%（浓香型）。杂环氨基酸含量最低仅占游离氨基酸总量的 0.00%（清香型）～2.16%（酱香型、药香型）。由此分析知，酱香型成品酒中性、杂环氨基酸含量最高，羟基氨基酸含量最低;浓香型碱性、含硫和芳香族氨基酸含量最高，酸性氨基酸含量最低;清香型成品酒酸性氨基酸含量最高，碱性、杂环和芳香族氨基酸含量最低;而凤香型中性、含硫和芳香族氨基酸含量最低。

不同香型的成品酒游离氨基酸种类有差异（见表7）:酱香型氨基酸种类最多（检测到18种）;其次是浓香型成品酒（16种）;豉香型氨基酸种类最少（仅12种）。在酱香型成品酒中检测到缬氨酸，其含量约占氨基酸总量的5.51%，而在其它香型白酒中未检测到。

不同香型成品酒同一种氨基酸含量差异不同:谷氨酸、天冬氨酸、瓜氨酸、苏氨酸、甘氨酸、精氨酸和脯氨酸在不同香型白酒中含量差异不大，其中谷氨酸、天冬氨酸、瓜氨酸、苏氨酸和甘氨酸含量均比较高，占氨基酸总量的 78.93%（浓香型）～94.55%（药香型）;其它氨基酸在不同香型白酒中含量差异较大（见表7）。与威士忌游离氨基酸含量相比，白酒成品酒中的丝氨酸、组氨酸含量略低，丙氨酸、精氨酸、酪氨酸、亮氨酸和赖氨酸基本保持在同等含量水平，其他氨基酸均高于威士忌;与朗姆酒相比，白酒成品酒的丝氨酸、组氨酸含量略低，丙氨酸、赖氨酸和脯氨酸含量基本保持在同等含量水平，而其它氨基酸含量均高于朗姆酒;与巴西甘蔗酒相比，白酒成品酒中丝氨酸、组氨酸和赖氨酸含量略低，脯氨酸含量基本持平，其它氨基酸含量均高于巴西甘蔗酒［3］。

2.2.2 不同香型成品酒氨基酸的单因素方差分析 对7个香型白酒成品酒的单因素方差分析结果进行统计（见表7），结果表明:酱香、浓香和兼香型成品酒的氨基酸组成与其它香型差异显著，其中酱香型成品酒的天冬氨酸、瓜氨酸、苏氨酸、丝氨酸、缬氨酸与其它香型差异性显著，浓香型的蛋氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸与其它香型有显著性差异，兼香型的蛋氨酸与其它香型差异性显著;就氨基酸而言，不同香型成品酒的天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸含量有显著差异。

表7 不同香型成品酒游离氨基酸含量Table 7 The content of free amino acid in different aroma type Chinese liquors

由于不同香型的白酒，酿酒原料、微生物种类、发酵条件、老熟过程和蒸馏过程各不相同，因而其氨基酸组成也有差异。

3 结论

对不同香型白酒原酒和成品酒的游离氨基酸进行比较分析，这是首次对白酒游离氨基酸进行系统研究。原酒游离氨基酸总量 12.19～131.14mg/L，浓香型氨基酸总量最高，豉香型最低;且酱香型和浓香型原酒的氨基酸种类最多，豉香型最少;经过单因素方差分析，老白干香型、酱香型和浓香型原酒与其它香型的氨基酸组成差异性显著，就氨基酸而言，谷氨酸、天冬氨酸、瓜氨酸、苏氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、脯氨酸和甘氨酸在不同香型原酒中有显著差异。成品酒游离氨基酸总量 13.66～34.01mg/L，浓香型氨基酸总量最高，兼香型最低;且酱香型酒的氨基酸种类最多，豉香型最少;经过单因素方差分析分析，酱香型、浓香型和兼香型成品酒与其它香型的氨基酸组成差异显著，就氨基酸而言，天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸在不同香型成品酒中有显著差异。

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