铁线莲属蒙药材中黄酮和三萜类化合物的薄层鉴别△

李 骁 徐晶光 侯 雪 赵 科 解红霞

(1.内蒙古医科大学药学院，内蒙古 呼和浩特 010029;2.内蒙古医科大学附属医院，内蒙古 呼和浩特 010059)

铁线莲属(Clematis)隶属于毛茛科，全世界约有300种，广泛分布于除南极洲以外的各大洲。我国约有108种，各地均有分布［1］。内蒙古地区有16种6变种［2］，经本草考证［2-5］，其中入蒙药的植物有:芹叶铁线莲(Clematis aethusifolia)、黄花铁线莲(C.intricata)、长瓣铁线莲(C.macropetala)、短尾铁线莲(C.brevicaudata)、棉团铁线莲(C.hexapetala)和辣蓼铁线莲(C.mandshurica)(又名:东北铁线莲［6，7］)。铁线莲属植物具有镇痛、抗菌、消炎和抗癌等多种药理活性，其药理作用与化学成分密切相关，化学成分主要为皂苷类、黄酮类、生物碱;此外还包括挥发油、特有成分及花色苷、香豆素、有机酸类、烷烃等其他化合物［8］。铁线莲属蒙药材主要含有三萜类、黄酮类和生物碱类化合物［9］。

黄酮类化合物具有抗氧化［10］、清除自由基［11］、调节心血管系统［12～13］、抗癌防癌［14～15］、抗衰老［16］、抗炎抑菌［17］等功效，还具有吸收紫外辐射、抗过敏及保肝［18］等作用。三萜类化合物具有消炎［19］、抗菌［20］、抗肿瘤［21］、保肝［22］、免疫调节［23］、调节心血管系统［24］、抗衰老［25］、神经保护［26］等作用。

有关铁线莲属蒙药材化学成分的鉴别研究，多为对某种铁线莲的单一化学成分进行鉴别研究［27］，然而对铁线莲属入蒙药的6种铁线莲主要化学成分(黄酮类和三萜类)进行整体化、系统化鉴别研究还未见报道。本研究主要通过薄层色谱法对铁线莲属蒙药材中的黄酮类和三萜类化合物进行鉴别，从而为铁线莲属蒙药材的质量控制提供依据，为其黄酮类和三萜类化合物的深度开发利用奠定基础。

1 实验材料

1.1 药材:棉团铁线莲(Clematis hexapetala)，芹叶铁线莲(C.aethusifolia)，黄花铁线莲(C.intricata)，短尾铁线莲(C.brevicaudata)，辣蓼铁线莲(C.mandshurica)，长瓣铁线莲(C.macropetala)的植株干燥全草。蒙药材原植物均经笔者鉴定，凭证标本保存于内蒙古医科大学药学院药用植物标本室。

1.2 对照品:齐墩果酸(中国药品生物制品检定所，110709-200505)、熊果酸(中国药品生物制品检定所，1107042-200516)、长春藤皂苷元(中国药品生物制品检定所，111733-200502)、芦丁(自制)、槲皮素(自制)、山奈酚(中国药品生物制品检定所，110861-200808)

1.3 仪器:HC-TP11-5架盘药物天平(上海精科天平)、ZF-20D暗箱式紫外分析仪(南京科尔仪器设备有限公司)、玻璃板(20cm ×20cm、10cm ×20cm)。

1.4 试剂:浓硫酸、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、1%氯化铝溶液、香草醛、冰乙酸、甲酸、硅胶GF254(青岛海洋化工有限公司制造)、羧甲基纤维素钠(天津市光复精细化工研究所)。

2 药材来源

于2009～2011年药材采收期采集6种铁线莲植物全草，置于阴凉通风干燥处储存。药材来源详见表1。

表1 药材来源及采集时间

3 理化鉴别

3.1 药材粗提物的制备:取6种铁线莲干燥全草粉碎，称取粉末10g，加95%乙醇60～70mL，过夜。水浴回流加热提取1h(溶液保持微沸)，过滤。滤渣加入95%的乙醇40～60mL，水浴加热提取30～40mins，过滤;滤渣再加入95%乙醇50～60mL，水浴加热提取30～40mins，过滤。合并滤液，浓缩备用。

3.2 黄酮类的检识［28］:盐酸-镁粉反应:取适量浓缩液于试管中，加入1mL甲醇，摇匀，加入少量镁粉振摇，再加入几滴浓盐酸，1min后观察现象，若反应试液显紫红色，说明反应结果呈现阳性。

三氯化铝反应:取适量浓缩液于试管中，用吸管吸取试液滴加于滤纸上成两排，再于下排滴加三氯化铝溶液，上排作为空白对照。将滤纸置于紫外灯下观察，若滴加有三氯化铝溶液的一排在紫外灯下呈现淡黄色荧光，说明反应结果呈阳性。

三氯化铁反应:取适量浓缩液于试管中，加入三氯化铁的乙醇溶液，观察反应现象，若试液呈现紫色，说明反应结果为阳性。

上述实验阳性结果表明药材粗提液中含有黄酮类化合物。

3.3 皂苷类的检识［28］:Libermanm-Burchard反应:取浓缩液适量于试管中，加入乙酸酐并混匀，加入几滴浓硫酸-乙酸酐(1:20)，观察反应现象，试液显示颜色变化。若药材提取物中含有三萜皂苷，试液颜色一般由黄色转变为红色、紫色、蓝色、污绿色。

Salkowaki反应:将浓缩液溶于适量CCl4中，然后沿试管壁慢慢加入到浓H2SO4中，如两液面交界处出现深红色或棕红色，说明样品中含有三萜皂苷。

泡沫试验:取适量浓缩液于试管中，强烈振摇后静置10mins，观察现象，经强烈振摇后若产生持久性白色泡沫，则表明药材提取物中含有皂苷类化合物。

3.4 检识结果:如表2所示，6种铁线莲在盐酸-镁粉、三氯化铁、三氯化铝反应中均呈现阳性结果，说明6种铁线莲中均含有黄酮类化合物。6种铁线莲在Libermanm-Burchard反应、Salkowaki反应、泡沫试验中均呈现阳性结果，说明6种铁线莲中均含有三萜皂苷类化合物。

表2 6种铁线莲药材粗提液理化鉴别情况一览表

4 薄层鉴别

4.1 供试品的制备:按表1第一批、第二批提取。将铁线莲属6种药材的全草剪碎，分别称取约5g，分别加70%乙醇70mL，浸泡过夜。水浴回流加热提取1h(溶液保持微沸)，过滤;滤渣中加入70%的乙醇60mL，水浴加热提取30min，过滤;将2次滤液合并，水浴蒸干，加少量无水乙醇溶解，10mL容量瓶中定容，作为供试品溶液。将6种药材按前述方法，分别用95%乙醇再提取。

4.2 对照品的制备:取槲皮素、山奈酚、齐墩果酸、熊果酸对照品适量加无水甲醇溶解，作为对照品溶液。

4.3 薄层层析

4.3.1 黄酮类的薄层层析:用毛细管吸取对照品溶液各2μL，供试品溶液各5μL点于同一块硅胶板，以甲苯:乙酸乙酯:甲酸(9:3:1)为展开剂［29］，展距 10cm，取出，晾干，喷以1%三氯化铝醇溶液，晾干，置紫外灯(365nm)下检视，在供试品谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的荧光，结果详见图1。

结果显示:如薄层图谱所示，山奈酚标准品对应位置上，只有第二批70%的棉团铁线莲含有，其他供试品在365nm的紫外荧光下在相同位置下均未见相同荧光;而在自制槲皮素标准品相应位置上，第一批和第二批供试品中，70%和90%的供试品在365nm紫外荧光下，均有荧光，只是各自的含量有所差异，因而所显荧光深浅也不同。

图1 铁线莲属蒙药材黄酮类化合物的薄层层析鉴别图谱

4.3.2 三萜皂苷类的薄层层析:用毛细管吸取对照品溶液各2μL，供试品溶液各5μL点于同一块硅胶板，以甲苯:乙酸乙酯:冰乙酸(14:4:0.5)为展开剂［27］，展距 10cm，取出，晾干，喷以香草醛浓硫酸溶液，在105℃的条件下烘干，在供试品谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同的颜色，结果详见图2。

结果显示:如上图谱所示，在标准品显色的位置上，第一批和第二批的70%和95%的供试品均在与供试品同一位置上显色，且齐墩果酸显紫色，与供试品所显颜色相同，而熊果酸在同一位置上也显色，但是颜色接近橘红色。

图2 铁线莲属蒙药材三萜类化合物的薄层层析鉴别图谱Fig2.TLC of Triterpenoid Saponins of six species in Clematis

5 结论

通过对铁线莲属蒙药材的化学成分的理化检识，6种铁线莲中含有黄酮类和三萜类化合物;棉团铁线莲中含有山奈酚;芹叶铁线莲、黄花铁线莲、短尾铁线莲、棉团铁线莲、长瓣铁线莲及辣蓼铁线莲中均含有槲皮素。6种铁线莲蒙药材中均含有齐墩果酸。

6 讨论

试验中针对含量测定配制供试品溶液的不同提取方法，不同提取溶剂(70%乙醇、95%乙醇和水)，分别考察。结果以70%及95%乙醇回流提取1.5h效果最好，杂质较少。

铁线莲的薄层色谱鉴别，根据文献香椿［29］的TLC展开条件对样品进行鉴别，经反复试验，采用甲苯-乙酸乙酯-甲酸(9:3:1)溶液为展开剂进行展开，对于黄酮类成分分离效果较好，薄层鉴别荧光斑点清晰、明确;根据文献［27］对齐墩果酸的测定，最终采用甲苯-乙酸乙酯-冰乙酸(14:4:0.5)溶液为展开剂，分离效果较好，斑点清晰。

内蒙古铁线莲属植物资源丰富，有16种6变种［2］，除本实验研究的入蒙药的6种铁线莲以外，还可入药的有大叶铁线莲、西伯利亚铁线莲和甘青铁线莲［9］。通过本研究对铁线莲属蒙药材中黄酮类和三萜类化合物的薄层鉴别，为铁线莲属蒙药材不同采收期主要化学成分(黄酮类和三萜类化合物)的变化研究和资源化学研究奠定了前期工作基础，从而为该属蒙药材的质量控制提供依据。

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