蛋白质翻译后修饰研究概述

邱望仁 邹国英 查娟娟 霍立田

(景德镇陶瓷学院信息工程学院，江西 景德镇 333403)

0 引言

在整个生物发展过程中，蛋白质翻译后修饰可以协调并控制绝大多数蛋白的活跃程度，正是因为有蛋白质翻译后修饰，使得一个基因并非只对应一个蛋白质，从而赋予了人类生命过程更多的复杂性。因此对这一过程的蛋白进行注解变得不容或缺。在基础医学和对疾病机理的研究中，熟知人类在各阶段的生长发育期及心理、病理发生改变的原因和情况对研究各类基因进行细胞表达所具有特征拥有特别意义。对这一方面的探究或许能发现与存在特殊的心理及病理状态有联系的分子，而这些分子为将来构思针对于特定靶分子的药用蛋白打下了良好根基。因此，了解蛋白翻译后修饰的原理、种类及作用对防患重大癌症有特殊功效。

1 常见的翻译后修饰的类型及生物功能

蛋白质的翻译后修饰进程具有繁杂性及多样性，现今在对真核生物的探究中，就发现了20多种不同的修饰范例。在目前的探究发现，比较常用的类别就有甲基化、乙酰化、糖基化、磷酸化、酯基化以及近年发现的泛素化与SUMO化这七种［1］。

1.1 甲基化

甲基化是指从活性甲基化合物(如S-腺苷基甲硫氨酸)上将甲基催化转移到其他化合物的过程。可形成各种甲基化合物，或是对某些蛋白质或核酸等进行化学修饰形成甲基化产物。甲基化是蛋白质和核酸的一种重要的翻译修饰，调节基因的表达和关闭，与癌症、衰老、老年痴呆等许多疾病密切相关，是表观遗传学的重要研究内容之一。最常见的甲基化修饰有DNA甲基化和组蛋白甲基化［2］。

1.2 乙酰化

乙酰化其主要讲把一种乙酰官能基团添加到另一种有机化合物上，并进行结合的过程。

蛋白质中的赖氨酸乙酰化修饰调控蛋白质的多种性质，包括DNA-蛋白质相互作用、蛋白质稳定性、亚细胞定位、转录活性等［3］。除了这些重要的生物学功能以外，赖氨酸乙酰化蛋白质及其调控酶与衰老及几种重大疾病(如癌症、心血管疾病、神经变形紊乱等)紧密相关。最近，Kim Orth及其同事在研究耶尔森菌属的效应因子YopJ(一个细菌毒力因子)时，发现在真核生物中存在着一种重要的翻译后修饰形式:丝氨酸和苏氨酸的乙酰化修饰。丝氨酸和苏氨酸的磷酸化和O-糖基化修饰可以导致细胞信号传导机制的重大改变，Kim Orth及其同事发现在YopJ中，丝氨酸和苏氨酸的乙酰化修饰与这些氨基酸的磷酸化修饰相互竞争，从而改变细胞的信号通路机制。

1.3 糖基化

糖基化的过程主要是在糖基转移酶的帮助下，使低聚糖以糖苷的方式移动到蛋白质分子上，并与蛋白质分子上特定的氨基酸残基进行共价结合作用而构成糖苷键的经过。蛋白质发生糖基化反应，从而有糖蛋白这种物质的产生，此过程一般在内质网上发生，并且糖基化拥有很多功效，主要是对调控蛋白质发生修饰和改善蛋白质的生物作用［4］。

1.4 磷酸化

蛋白质磷酸化指由蛋白质激酶催化的把ATP或GTPγ位的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基(丝氨酸、苏氨酸)上的过程，是生物体内一种普通的调节方式，在细胞信号转导的过程中起重要作用。蛋白质进行磷酸化是所有生物中进行的最广泛、最独特，并且亦是最具效率的一类蛋白质翻译后修饰进程。在生物体中，进行磷脂化修饰的蛋白只有三分之一，别看这个数目小，但其实相对其他修饰而言其修饰是非常庞大的。并且研究发现，有几百种磷酸激活酶已经被人类基因翻译及转录过［5］。其与多个生理有关，并和疾病的产生过程有一定的联系，如:神经的活跃、信号的传导、细胞的生长发育、肿瘤癌的产生及肌肉频繁萎缩等。

1.5 酯基化

蛋白质酯基化的一般作用过程是利用氧和硫原子使脂链连接到蛋白物质上，从而形成脂蛋白的缀合物，在这个进程中常会有蛋白分子内所含的半胱氨酸发生法呢基烷基化，或者棕榈酰基乙酰化，其作用位点通常是硫键。硫和氧原子被修饰的脂链能改变所结合蛋白的功能，因为这个蛋白中的生物磷脂膜能与脂链相互吸引并溶合，所以此蛋白会被牵制在细胞膜上不能动弹，其功能也就受到限制及改变。

由于具有脂链的蛋白能促使其在特定的细胞膜上进行固定，而且能够调控此蛋白施展其有益及高效的生物作用［6］。最近几年，有科学家证明，脂蛋白缀合物要想正常发挥其生物功能，必须首先被吸收到细胞膜上才可以，所以蛋白酯基化的作用是不容忽视的。

1.6 泛素化

泛素化是指泛素分子在一系列特殊的酶作用下，将细胞内的蛋白质分类，从中选出靶蛋白分子，并对靶蛋白进行特异性修饰的过程。蛋白质泛素化作用是后翻译修饰的一种常见形式，该过程能够调节不同细胞途径中各式各样的蛋白质泛素蛋白底物。泛素化在蛋白质的定位、代谢、功能、调节和降解中都起着十分重要的作用。同时，它也参与了细胞周期、增殖、凋亡、分化、转移、基因表达、转录调节、信号传递、损伤修复、炎症免疫等几乎一切生命活动的调控。泛素化与肿瘤、心血管等疾病的发病密切相关［7］。因此，作为近年来生物化学研究的一个重大成果，它已然成为研究、开发新药物的新靶点。

1.7 SUMO化

SUMO(small ubiquitin—related modifier)分子结构和SUMO化反应途径都与泛素相似，都参与蛋白质翻译后修饰，SUMO化修饰与泛素化修饰二者的功能上完全不同。SUMO化修饰可参与转录调节、核转运、维持基因组完整性与信号转导等多种细胞内活动，是一种重要的多功能的蛋白质翻译后修饰方式。和泛素化不同的是SUMO化修饰不会导致蛋白质的降解，但作用于不同底物会产生不一样的影响，也就是说，SUMO化修饰的后效取决于它作用的底物［8］。但是它们都是一些重要的细胞调节蛋白。SUMO生物功能表现在以下6个方面:(1)蛋白的亚细胞定位;(2)转录活性调控;(3)蛋白稳定性调节;(4)细胞周期调控;(5)维持基因组完整性;(6)信号转导调控。

2 研究方法及关键技术

2.1 甲基化研究方法及关键技术

2.1.1 甲基化特异性的PCR

其基本原理是把所有的基因组DNA用亚硫酸氢盐进行处理，如此做是因为尚未发生甲基化修饰的胞嘧啶都会被作用变为尿嘧啶，但进行甲基化修饰的胞嘧啶则不会发生改变［9］。由上面的原理可知，采用不同种类的引物做PCR，即可检测出这种微弱的变化，这样就能确定基因是否存在甲基化。

2.1.2 亚硫酸氢盐测序法

它是利用重亚硫酸盐对DNA进行处理，此过程会使没有进行甲基化的胞嘧啶变为尿嘧啶，但进行甲基化的基团则不会。然后把经作用的物质为基础，加入甲基化特异性的物质(primerI)或者非甲基化的物质(primerII)，使其进行特异性的扩增［10］。

2.1.3 高分辨率熔解曲线法

在非CpG岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物，这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化，用亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，样品中的GC含量发生改变，从而导致熔解温度的变化。

2.2 乙酰化研究方法及关键技术

2.2.1 通过生物质谱鉴定乙酰化修饰位点［11］

质谱技术通过检测到的肽段的质量与预测的肽段的质量进行对比，如果二者质量相差42amu，则认为在氨基酸残基或在蛋白质末端发生乙酰化修饰。通过从鉴定到的肽段的N末端或C末端逐个分析得到的b离子或y离子，就可以确定发生乙酰化修饰的氨基酸位点。

2.2.2 基于特异性识别乙酰化赖氨酸残基的乙酰化抗体

对于赖氨酸的乙酰化修饰，Kim及其同事用免疫亲和纯化技术富集赖氨酸乙酰化修饰的肽段，在Hela细胞的细胞质、细胞核和线粒体中发现了195种赖氨酸乙酰化修饰蛋白。但是，赖氨酸乙酰化抗体只能特异性识别赖氨酸残基发生修饰的蛋白质或肽段，不能检测到丝氨酸和苏氨酸的乙酰化修饰。用特异性识别丝氨酸或苏氨酸乙酰化修饰的抗体将大大有利于丝氨酸和苏氨酸乙酰化修饰的蛋白质组学分析。

2.2.3 以标记底物为基础的方法

Yu及其同事在酶GNAT的作用下，用氯代乙酰化CoA与其作用底物L12反应，导致氯代乙酰化L12的生成。然后将氯代乙酰化L12与荧光素His18俘获的肽段一起孵育，经过氯消除后，纯化后的标记的底物通过荧光自显影便可看到。

德育教育与知识教学是相辅相成的。学生只学到知识而没有基本品德的建立，那么我们培养的仅仅是“书呆子”。学生学习成绩不好，但是有良好的思想品德，我相信这样的学生也是会得到社会的认可的。因此，德育教育比知识教育更为重要，有良好的思想品德作基础，我们的基础教学可以更高效地开展。在实际工作中，有效开展德育工作可以从以下几点入手。

2.3 糖基化的研究方法及关键技术

2.3.1 放射性标记法

其过程分为以下几步进行:首先，是对所需的糖进行特殊标记;其次，把处理好的糖加入培育好的细胞或组织中［12］;最后，就利用放射性自显影技术对其进行鉴定。

2.3.2 分子荧光标记法

鉴定糖基化蛋白最为普遍和最具效率的技术当属荧光分子标记法，其基本原理是因为一部分的糖蛋白拥有自发光特点，所以能直接采用所检测的荧光值说明蛋白进行糖基化修饰的程度，荧光值是利用荧光分光计来测量的。

2.3.3 电泳法

最古老对糖蛋白进行鉴定的技术便指电泳法，其包含单、双向电泳两种，这两种技术能够鉴定出糖蛋白。日常使用亲和电泳比色法和SDS-PAGE法对糖基化程度的高低及糖基化中是否发生血红蛋白的隔离进行鉴定［13］。

2.3.4 凝集素标记法

2.3.5 抗体标记法

抗体标记法是针对糖蛋白所带糖链的类型制备各种抗体，对糖蛋白进行检测。

2.3.6 化学酵素法

生物学家Khidekel是最早研究此类技术的，他很早便发现了一种叫半乳糖基转移酶的物质，这种物质的功能非常强大，能使糖蛋白自动地携带含酮基的蛋白毒素抗体。

2.4 磷酸化的研究方法及关键技术

如今，在对磷酸化肽和磷酸化蛋白质的探究中，对它们之间富集、分离及检测所采用的技术非常之多，在此主要介绍四类办法［14］:

2.4.1 免疫沉淀法

此技术的作用机制是要制备出一种特殊的抗体，它能对所有含磷酸化残基的蛋白进行免疫沉淀，从而能高效地鉴定磷酸化蛋白。

2.4.2 流式细胞仪

实验证明，流式细胞仪不仅可以测试转录活化基因STAT的活跃性和检测信号传导的作用，还能利用它检测荧光强度，来分析酪氨酸磷酸化蛋白的浓度大小。

2.4.3 双向凝胶电泳法

现今国际上一般是利用2D凝胶电泳对磷酸化蛋白进行鉴定的，此项技术已经在得到科学家的广泛认可，及得到普遍的应用。

2.4.4 固相金属亲和色谱

研究发现，这种方法最开始是被应用在磷蛋白进行亲和纯化的过程中，固相金属和磷蛋白中的磷酸残基之间具有不错吸引力，从而使得这些离子能够被固定在糖蛋白上，最后利用IMAC柱就可以聚集那些进行磷基化的蛋白质，从而对磷蛋白进行了鉴定。

2.5 酯基化的研究方法及关键技术

就当今研究结果而言，所了解到的蛋白酯基化仅有四类:十四酰化、十六酰化、异戊烯化法呢基化、香叶基香叶基化。

生物学家Kho使用了tagging-via-substrate方法［15］，其首先对异戊烯化法呢基团进行加氮处理，并把它添加到已经培养好的小鼠细胞溶液中，利用小鼠细胞进行新陈代谢这一生物功能，把含氮的法呢基团与酯基化作用的靶点相结合。由于异戊烯化法呢基团上的氮基团能够和被生物素所标记的三芳基膦脂这种物质进行作用，所以最后可以采用对标记物进行鉴定的方法来检验脂蛋白是否产生。

2.6 泛素化与SUMO化修饰的研究方法

一般先利用6xHis这种物质对泛素蛋白进行标记处理，再利用螯合亲与色谱技术来聚集来检测泛素化蛋白质。研究发现泛素蛋白的碳尾部为Arg-Gly-Gly的构造［16］，若用胰蛋白酶对它作用并发生降解反应时，Gly-Gly这个基因片段仍仍能够被保留在泛素蛋白的肽链结构上，导致肽链基团的基因片段剧增一百多段，后面再利用串联质谱法来检测泛素化的作用靶点。

综上所述，目前所具有的对泛素蛋白探究的技术是非常少的，所具有的类型也很单调。对泛素蛋白的检测、泛素作用靶点的定位以及泛素蛋白本身性质的探究方法中，这些技术还必须进行不断的改进和完善。除了泛素化修饰之外，还发现名为类泛素化修饰，类泛素化修饰(SUMO)是泛素化修饰的又一作用类型，它们之间具有显著的序列同源性，在多数条件下，它们都能够利用类似的作用机制来促使蛋白共价修饰的形成。现今科学界中，大量的和蛋白泛素化修饰雷同的探索技术也都利用到对类泛素化(Sumoylation)的探究发现中。

3 翻译后修饰的研究展望

一方面，由于蛋白质的生物学功能不管是对人类还是对动物来说，都有着非常重要的意义，而翻译后修饰是使蛋白质发挥其重要生物学功能的基石，所以这也是为什么要对此方面问题的讨论花费巨大的时间与精力，及研究如此深入。时至今日，在生物界中所发现的翻译后修饰的种类不计其数，已经记录在册的就超过了400多种，并且科学家们还在不断地探索发现。翻译后修饰存在时空特异性的特点，主要表现在:若生物的内在状态发生变化时，翻译后修饰的种类也会有所改变，其修饰程度还会随着环境的改变而变化，而且某些修饰还是转瞬即逝的，因此，定量研究翻译后修饰及为重要。另一方面，尽管大规模翻译后修饰蛋白质的研究已经轰轰烈烈的进行，我们采用现有的技术也可以鉴定一定数量的翻译后修饰蛋白，但是针对整个翻译后修饰蛋白质组学来讲，这些已作的研究很可能只是沧海一粟。因此翻译后修饰的种类、过程以及其生物学功能还有待于进一步的研究和发现。即便如此，相信随着科学的发展，这类问题都将迎刃而解，相信在不久的将来，新的翻译后修饰的作用将会被发现，定量技术的发展应用也会日趋完善，人们对翻译后修饰蛋白质的认识将更为深刻，这也必将加深人们对蛋白质生物功能多样性的认识和体内信号网络通路的理解。

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