地鳖多肽提取物的抗氧化衰老机制

谷崇高，张永红，白若雨，田美杰，沈红

(北京农学院动物科学技术学院，兽医学(中医药)北京市重点实验室，北京 102206)

地鳖(EupolyphagasinensisWalker，ESW)为活血化瘀类中药，《神农本草经》记载其味咸，性寒，归肝经，具有破血逐瘀的功效[1]。现代研究表明，地鳖提取物具有良好的抗肿瘤，抗氧化，增强免疫功能的作用[2]。1955年美国科学家Hannan提出衰老自由基学说，认为体内过多的自由基可引起衰老[3]。机体自身具有抗氧化体系，通过提高体内超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽含量，补充抗氧化物质等，提高机体抗氧化能力，清除多余自由基，但是随着年龄增长、疾病发生等情况，易造成抗氧化体系失衡[4]。天然产物抗氧化剂可以提高机体抗氧化能力，维持体内氧化还原的平衡尤为重要。抗氧化多肽具有抑制生物大分子过氧化和清除体内自由基功能的小分子多肽，有研究人员采用蛋白酶水解制备地鳖多肽，体外试验其能清除自由基，结果表明地鳖多肽具有抗氧化活性[5-6]，但有关其抗氧化机制未见报道。细胞核转录因子2-抗氧化反应元件(Nrf2-ARE)是抗氧化应激损伤的重要信号通路，可调控血红素加氧酶(HO-1)等在内的多种抗氧化酶的表达，从而对细胞产生保护作用[7]。Nrf2-ARE信号通路的核心分子Nrf2位于胞质，正常情况下是无活性状态，在活性氧等信号刺激下，Nrf2被激活移入核内与ARE结合激活靶基因的表达，调节抗氧化酶/蛋白的转录，保护机体免受活性氧等物质侵害，抑制氧化应激引起的细胞衰老[7-8]。叔丁基对苯二酚是Nrf2激活剂，可以激活Nrf2-ARE信号通路，使Nrf2在细胞核表达增加，促进抗氧化蛋白的表达[9]。

本研究通过体内外试验，分析小鼠血液和组织中抗氧化酶活力、细胞内抗氧化信号通路关键分子Nrf2表达，探讨地鳖多肽提取物抗氧化衰老作用及机制，为开发地鳖多肽作为抗氧化衰老保护剂提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与仪器

Caco-2细胞株，购于中国科学院上海细胞生物学研究所；DMEM高糖培养基、双抗、胎牛血清(FBS)等，购于美国Gibco公司；兔源Nrf2多克隆抗体，购于美国Abcam公司；FITC-羊抗兔IgG，购于北京博奥森有限公司；地鳖多肽提取物为本实验室提取制备；硫代巴比妥酸(TBA)、D-半乳糖((D-gal)，购于美国Sigma公司；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和过氧化氢酶(CAT)试剂盒、还原型谷胱甘肽(GSH)含量试剂盒，购于南京建成生物工程研究所；UV-3紫外可见分光光度计，购于上海美普达有限公司；荧光倒置显微镜购于日本Olympus公司。

1.1.2 实验动物

6～8周龄KM雌性小鼠80只，体重20～22 g，清洁级，购于中国军事医学科学院实验动物中心【SCXK-(京)2012-001】。无菌手术在北京农学院实验动物示范中心屏障动物实验设施进行 【SYXK (京)2010-0003】，并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。

1.2 方法

1.2.1 实验分组

取80只KM小鼠随机分五组，对照组(C)，衰老模型组(M)，低、中、高剂量(40、80、160 mg/kg)地鳖多肽组，每组16只。除对照组小鼠外，其余所有小鼠每天腹腔注射5%D-半乳糖0.5 mL，连续注射20 d，建立衰老小鼠。多肽组小鼠每天需灌服不同剂量地鳖多肽提取物，对照组和衰老组小鼠每天灌服等量生理盐水，连续给药20 d。

1.2.2 衰老小鼠运动能力的测定

(1) 静力性运动能力测定：取长2m、直径0.5 cm的悬垂导线，将各组小鼠置于距导线末端12 cm处，记录小鼠3次从抓住线绳至掉落的时间。

(2) 运动性运动能力测定：取各组小鼠将其尾负重100 g/kg的重物，然后放入50 cm×40 cm×30 cm的水箱中游泳，水温(28±2)℃，记录下小鼠连续3次沉入水中的时间。

1.2.3 衰老小鼠耐应激能力的测定

(1) 力竭游泳测定：将各组小鼠放入水箱中，观察游泳，记录小鼠的死亡时间。

(2) 耐高温测定：将部分小鼠放入50℃干热箱，记录小鼠的死亡时间。

(3) 耐缺氧测定：将各组小鼠放入含有碱石灰的广口瓶中，瓶口涂有白凡士林，密闭缺氧，记录小鼠的死亡时间。

1.2.4 SOD、CAT和GSH-PX测定

(1) 血清和血液的制备：末次小鼠灌胃24 h后眼眶采血，其中一部分小鼠血液加入离心管内，离心制备血清备用；另一部分小鼠血液加入含有肝素的离心管内，制备血液备用。

(2) 红细胞抽提液的制备：取小鼠血液50 μL加入盛有2 mL的生理盐水的离心管内，2000 r/min离心3 min，弃上清收集红细胞，向红细胞中加预冷的双蒸水0.2 mL混匀，然后加95%乙醇0.1 mL振荡30 s，再加三氯甲烷0.1 mL，置于漩涡混匀器上混匀1 min，3500 r/min离心8 min，收集上层红细胞抽提液，4℃备用。

(3) 脏器指数计算：小鼠颈椎脱臼处死，打开腹腔分离出肝脏、肾脏、脾脏、心脏组织，用预冷的生理盐水冲洗，滤纸吸干后称重，根据公式计算：脏器指数=脏器重/体重 × 100%。

(4) 组织匀浆上清液的制备：准确称取1 g不同组织放入小烧杯中，加9 mL预冷生理盐水，组织匀浆，收集匀浆液离心，弃去沉淀，制备10%组织匀浆上清液备用。

根据SOD、CAT和GSH-PX试剂盒说明，检测小鼠全血、血清、红细胞以及肝、肾、脾脏、心脏组织中的SOD、CAT和GSH-PX活力。

1.2.5 MDA、GSH含量测定

取1 mL组织匀浆上清液加入离心管内，置于-20℃冰箱10 min，然后放入37℃水浴锅水浴10 min，反复冻融破碎细胞，最后向离心管加1 mL 6% TBA溶液，沸水中煮沸15 min显色，冷却后离心，取适量上清液加比色杯内，紫外分光光度计检测A450，A532，A600吸光度值，根据公式计算：MDA浓度(μmol/L)=6.45 ×(A532-A600)- 0.56 ×A450。

取组织匀浆液、血液及血清，根据试剂盒要求，测定A405nm值，由标准曲线算出GSH含量。

1.2.6 免疫荧光法检测Nrf2在Caco-2细胞表达

(1) 细胞处理：复苏Caco-2细胞培养至对数生长期，将细胞加入24孔细胞培养板，药物处理细胞培养24 h。实验分三组，对照组为10%FBS DMEM培养基、阳性对照组为含终浓度为50 μmol/L tBHQ的10%FBS DMEM培养基、药物组为含终浓度为80 μg/mL地鳖多肽的10%FBS DMEM培养基。

(2) Nrf2表达检测：取板吸弃培养基，向孔内加入预冷的4%多聚甲酸1 mL，固定细胞20 min，用预冷PBS洗3次；加预冷0.3% Triton X-100，将细胞板置于冰上破膜15 min，PBS洗3次；每孔加200 μL山羊血清于37℃恒温封闭2 h，吸弃血清并PBS洗3次，每孔加50 μL兔源Nrf 2多克隆抗体，4℃孵育过夜，PBS洗3次；每孔加l00 μL FITC-IgG二抗，37℃避光孵育1 h。荧光显微镜下观察。

1.2.7 实验结果统计分析

实验数据以平均数±标准差表示，采用t检验分析比较各组数据，方差不齐时用t′检验，*P<0.05为差异有显著性，**P<0.01为差异有极显著性。

2 结果

2.1 一般情况观察

小鼠连续给药20 d后对照组和地鳖多肽组小鼠毛发光亮而浓密、皮肤富有弹性；衰老模型组小鼠出现衰老迹象，表现毛发稀疏、行动迟缓、采食量减少、皮肤松弛和弹性下降等。随饲养天数增加，对照组小鼠体重逐步增加，衰老模型组小鼠在1～15 d之间体重增加缓慢，15～20 d体重下降，与衰老模型组比较地鳖多肽组小鼠体重增加显著(图1)。衰老模型组小鼠的肝脏、脾脏和肾脏指数均低于对照组(图2)，高剂量地鳖多肽组肝脏指数显著高于对照组比和衰老模型组(图2A)，地鳖多肽组小鼠脾脏指数都高于对照组比和衰老模型组，其中低剂量多肽组小鼠脾脏指数提高最明显(图2B)，模型组小鼠肾脏指数显著低于对照组，与模型组相比地鳖多肽组小鼠肾脏指数略有提高(图2C)。

图1 地鳖多肽对衰老小鼠体重的影响

注：与C相比ΔP<0.05，与M相比**P<0.01。

2.2 地鳖多肽对衰老小鼠运动和耐应激能力的影响

实验分析了地鳖多肽对D-半乳糖致衰老小鼠的运动能力的影响，结果衰老模型组小鼠静力性和动力性运动时间明显低于对照组，地鳖多肽组小鼠运动时间显著高于衰老模型组，随地鳖多肽灌服量增加，小鼠运动时间逐渐延长(图3)。小鼠抗应激能力结果见图4，衰老模型组小鼠的耐高温、耐缺氧、游泳时间都显著比对照组缩短，而多肽组小鼠耐高温、耐缺氧和游泳时间比衰老模型组延长，随着小鼠灌服地鳖多肽量增加，小鼠耐高温、耐缺氧和游泳时间逐渐延长；高剂量多肽组小鼠游泳时间接近对照组(图4A)，多肽组小鼠耐高温时间高于模型衰老组但低于对照组(图4B)，中高剂量多肽组小鼠耐缺氧时间高于对照组(图4C)。结果表明地鳖多肽提高衰老小鼠的运动和耐应激能力，有延缓衰老作用。

注：与C相比ΔΔP<0.01，与M相比**P<0.01。

2.3 地鳖多肽对衰老小鼠SOD活力的影响

通过黄嘌呤氧化酶法测定小鼠组织和血液中SOD活力，结果见图5。与对照组和多肽组比较，衰老模型组小鼠肝肾组织中SOD活力显著降低；随着小鼠灌服地鳖多肽量增加，肝肾组织中SOD活力逐渐提高，中高剂量多肽组小鼠肝脏SOD活力提高最明显，而高剂量多肽组肾脏SOD活力极显著提高；多肽组肝脏SOD活力显著高于肾脏(图5A)。衰老组小鼠红细胞SOD活力显著低于对照组，多肽组小鼠红细胞中SOD活力极显著高于对照组，且存在量效关系(图5B)。结果表明地鳖多肽可以缓解甚至改善D-半乳糖致小鼠SOD活力的降低，提高抗氧化酶的活力。

注：A.游泳时间；B.耐高温时间；C.耐缺氧时间。与C相比ΔΔP<0.01，与M相比**P<0.01。

2.4 地鳖多肽对衰老小鼠CAT活力的影响

通过紫外分光光度法测定CAT活力，结果如图6。衰老组小鼠肝肾心的组织中CAT活力显著低于对照组，而地鳖多肽组小鼠CAT活力显著高于对照组，同时CAT活力随着地鳖多肽剂量增加而升高(图6A)。衰老组小鼠血液中CAT活力均显著低于对照组和多肽组，中高剂量多肽组CAT活力提高最显著，且CAT活力随着地鳖多肽的剂量升高而升高(图6B)。结果表明地鳖多肽能提高衰老小鼠CAT抗氧化酶的活力。

2.5 地鳖多肽对小鼠GSH-PX活力的影响

通过分光光度法测定GSH-PX活力，结果见图7。衰老模型组小鼠肝肾组织中GSH-PX活力显著降低对照组和多肽组，地鳖多肽组小鼠肝组织中GSH-PX活力接近对照组，高剂量多肽组小鼠肾中GSH-PX的活力最显著升高，GSH-PX活力在肝脏组织高于肾脏(图7A)。衰老组小鼠血液中GSH-PX活力低于对照组，与衰老组相比，低、中剂量地鳖多肽组小鼠血液中的GSH-PX活力变化不大，高剂量地鳖多肽组GSH-PX活力显著升高(图7B)。结果表明地鳖多肽可提高衰老小鼠血液GSH-PX抗氧化酶的活力。

注：A.不同组织；B.红细胞。与C相比ΔP<0.05，与M相比**P<0.01，*P<0.05。

注：A.不同组织；B.血液。与C相比ΔΔP<0.01，ΔP<0.05，与M相比**P<0.01。

注：A.不同组织; B.血液。与C相比ΔΔP<0.01，ΔP<0.05，与M相比**P<0.01。

2.6 地鳖多肽对小鼠不同组织MDA含量的影响

TBA比色法测定小鼠不同组织中MDA的含量，结果衰老模型组小鼠肝肾心脾组织中MDA含量高于对照组和多肽组，随着地鳖多肽增加各组织中MDA含量逐渐降低，高剂量多肽组MDA含量降低最明显；不同组织中MDA含量之间比较，肾组织中MDA含量高于肝心脾，心肌中最低(图8)。结果表明地鳖多肽可以缓解衰老小鼠组织中MDA升高，从而延缓组织脂质过氧化。

注：与C相比ΔΔP<0.01；与M相比**P<0.01，*P<0.05。

2.7 地鳖多肽对衰老小鼠GSH含量的影响

通过二硫二硝基苯甲酸(DTNB)显色法测定小鼠不同组织中GSH的含量，结果如图9显示。由图9知，与对照组比较，衰老模型组小鼠肝中GSH含量显著降低，地鳖多肽组肝中GSH含量高于衰老组，高剂量组小鼠肝中GSH含量显著升高；衰老模型组小鼠肾中GSH含量低于对照组，中高剂量多肽组小鼠肾GSH含量高于对照组和衰老组；多肽组小鼠心脏组织中GSH含量高于对照和模型组，以中高剂量组升高最明显(图9A)。地鳖多肽组血液中GSH含量均高于对照和衰老模型组，呈现剂量和效应关系，多肽组血液中GSH含量均高于衰老组(图9B)。结果表明地鳖多肽可以缓解甚至改善D-半乳糖致小鼠组织中GSH含量的降低，升高机体内抗氧化因子的含量，提高抗氧化能力。

2.8 地鳖多肽对Nrf2在Caco-2细胞表达的影响

通过免疫荧光法检测地鳖多肽对Caco-2细胞Nrf2表达的影响，结果如图10(见彩插14)所示，红色箭头指示的绿色荧光是Nrf2在细胞中的表达。对照组Caco-2 细胞胞质及胞核内极少量Nrf2表达(图10A)，tBHQ组Nrf2蛋白在细胞胞质及细胞核内的表达均较多肽组明显增高(图10B)；地鳖多肽组细胞胞质及胞核内Nrf2表达均明显增多(图10C)，接近阳性对照组。结果说明地鳖多肽可能启动Nrf2-ARE抗氧化信号通路，促进Nrf2和keap1解离后移入细胞核。

3 讨论

注：A.不同组织，B.血液。与C相比ΔΔP<0.01，与M相比**P<0.01。

美国科学家Hannan 1955年提出衰老的自由基学说，认为自由基攻击生命大分子造成组织细胞损伤是引起机体衰老的根本原因，为此建立衰老模型是研究机体衰老机制以及药物抗衰老机制的关键。衰老模型的建立有多种方法，其中D-半乳糖衰老模型建立的依据主要是自由基氧化损伤衰老学说，由于该模型具有造模方法简单、模型复制成功率高等优点，近年来它已成为研究抗衰老常用动物模型[10]。D-半乳糖致衰老的作用机制在于：第一，半乳糖在其氧化酶作用下，与氧反应生成二醛糖及H202，且半乳糖在体内亦可发生非酶糖基化反应，形成蛋白质交联[11]；第二，半乳糖在醛糖还原酶催化下还原生成半乳糖醇，细胞不能代谢半乳糖醇，使其在细胞内堆积，形成高渗透压致细胞肿胀和功能障碍，最终引起衰老[12]；第三，D-半乳糖可使生物体中产生大量的活性氧(ROS)，导致细胞线粒体系统损伤，产生大量过氧化脂质，同时ROS及其发生氧化反应后的过氧化产物，进一步导致MDA水平升高和SOD、GSH-PX及CAT等抗氧化酶活力下降，最终导致抗氧化水平降低甚至损伤，出现各种衰老变化[13]。本试验结果衰老模型组小鼠的体重升高缓慢甚至降低，运动和耐应激能力下降，肝肾脏器指数比对照组低，肝肾组织抗氧化酶SOD、CAT、GSH-PX活性降低，组织中氧化损伤产物MDA含量升高及抗氧化因子GSH含量降低，结果与文献报道相似[14]。

机体的稳态受到氧化和抗氧化体系平衡的影响，各种原因如ROS增加、外源性毒物、电离辐射等刺激，使机体的自由基水平明显增高，各种抗氧化物质如SOD、GSH、CAT等含量下降，抗氧化能力降低，超过机体抗氧化体系的清除能力，造成机体的氧化应激。机体的抗氧化体系由酶系统和非酶系统组成，而体内的抗氧化酶主要有SOD、GSH-PX和CAT等。地鳖多肽是一种通过蛋白酶水解地鳖虫得到的小分子多肽，前期研究结果表明地鳖多肽能清除自由基。本试验结果灌服地鳖多肽小鼠体重升高，肝肾组织脏器指数升高，小鼠运动能力、耐应激能力增强、抗氧化酶SOD、CAT、GSH-PX活性增强，组织中MDA含量显著降低，结果与Cui等[15]研究结果相似，进一步说明地鳖多肽可能是通过提高小鼠抗氧化能力来延缓氧化衰老。

机体的正常生理功能有赖于氧化/抗氧化系统的相互拮抗平衡，体内过多的ROS能攻击生物膜中不饱和脂肪酸，引发细胞氧化损伤。Nrf2-ARE是重要信号通路，机体应对氧化应激的防御机制之一是ARE，ARE是许多抗氧化酶/蛋白基因上游增强元件，Nrf2是Nrf2-ARE通路中的核心分子，在生理状态下Nrf2位于细胞质中，与胞浆蛋白伴侣分子(Keap1)结合，处于无活性状态，由泛素蛋白酶途径迅速降解。在活性氧簇或其它亲核剂信号刺激下，Nrf2 与Keap1解耦联后被激活转移入细胞核中，通过bZIP与小分子肌腱纤维瘤蛋白质(Maf)结合后形成稳定异二聚体，并与位于Ⅱ相代谢酶基因上游启动子区域的ARE结合，调控下游Ⅱ相酶和抗氧化酶基因的转录活性，如血红素单加氧酶-1(HO-1)、醌氧化还原酶(NQO1)等，这些酶能够保护机体免受活性物质等的侵害[8]。叔丁基对苯二酚(tBHQ)是Nrf2的激活剂，通过激活Nrf2蛋白，促迸Nrf2的核转位，增加其与ARE的结合，激活抗氧化蛋白基因的表达[9]。本实验通过地鳖多肽与tBHQ阳性药物作比较，通过实验结果说明验tBHQ阳性组和地鳖多肽组的细胞核内Nrf2表达极显著高于比对照组，结果与文献报道一致[16]。

综上所述，地鳖多肽具有提高机体的抗氧化能力，促进Nrf2核移位启动Nrf2-ARE抗氧化应激信号通路，提高抗氧化蛋白酶的转录表达，发挥抗氧化作用，从而延缓氧化衰老。

(本文图10见彩插14)。

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