诱发性2型糖尿病小鼠模型与自发性db/db小鼠特性的比较

刘芳，杨华，周文江,2，周晓辉

(1.上海市公共卫生临床中心，上海 201508；2.复旦大学药学院，上海 201203)

糖尿病已成为全球性的公共健康问题，是由于胰岛素分泌和/或作用缺陷而引起的以慢性血葡萄糖水平增高为特征的代谢紊乱性疾病，预计至2030年全球发病人数将达4.39亿,其中2型糖尿病约占90%[1]。国内外对糖尿病进行了大量的研究工作，但进展相对缓慢，主要原因是2型糖尿病病因多，发病机制复杂，具有高度的异质性,兼具有遗传免疫因素及环境因素的作用。

动物疾病模型的研究是人类疾病研究的基础，而至今没有一种公认的理想的动物模型与人类2型糖尿病特征完全吻合，不同类型的动物模型各有其特征和局限性，对于模型的选择应根据研究目的、实验条件和经费等具体情况而定[2]。

诱发性动物模型是通过物理、生物或化学等方式的作用，人为诱发出的具有类似人类疾病特征的动物模型，该类模型是通过人为限定方式而产生的，多数情况下与临床所见自然发生的疾病有一定差异。自发性动物模型是取自自然发生疾病的动物个体，或由于基因突变的异常表现通过定向培育而保留下来的疾病模型，该类模型在一定程度上减少了人为因素，其症状更接近于人类疾病。然而，对于同一种疾病的动物模型，究竟是用诱发性模型还是自发性模型来进行实验，相关比较研究的报道较少。

目前2型糖尿病小鼠模型主要包括自发性糖尿病小鼠、诱发性糖尿病小鼠、转基因及基因敲除小鼠[3]。db/db小鼠及高脂饲料加STZ小剂量诱导建立的糖尿病小鼠模型是目前广泛被认可的应用于研究人类2型糖尿病较好的动物模型。本文将诱发的2型糖尿病小鼠与自发的糖尿病小鼠的相关指标进行比较分析，并着重对两种小鼠的免疫指标进行分析，旨在为糖尿病研究工作者在如何选择动物模型方面提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级C57BL/6J小鼠40只，3周龄，购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司【SCXK(沪)2013-0016】。小鼠随机分为2组，正常组16只，糖尿病组24只。SPF级C57BL/KsJ(db/db)小鼠15只，4周龄，购于常州卡文斯实验动物有限公司【SCXK(苏)2011-0003】。动物实验在上海市公共卫生临床中心实验动物部进行【SYXK(沪)2010-0098】。

1.1.2 主要试剂、实验材料及仪器

链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)购自美国Sigma公司。CBA试剂盒购于美国BD公司。血糖仪及试纸条使用德国罗氏的罗康全活力型血糖检测系统(检测范围0.6～33.3 mmol/L即10-600 mg/dL)，超过检测上限的记录为33.3 mmol/L。罗氏MODULE P800全自动生化仪，罗氏公司。流式细胞仪BD FACS Aria I，美国BD公司。

高脂饲料由上海仕林生物科技有限公司【沪饲审(2008)04031】提供，配方为：基础料71.8%、猪油18%、蛋黄粉8%、胆固醇2%、胆盐0.2%。

1.2 实验方法

1.2.1 诱发性II型糖尿病小鼠模型的建立

糖尿病组小鼠喂以高脂饲料，正常组小鼠喂以基础饲料，持续4周。糖尿病组小鼠腹腔注射STZ 50 mg/kg体重，连续注射3 d[2,4,5]，继续饲喂高脂饲料；正常组小鼠腹腔注射柠檬酸缓冲液，连续注射3 d，饲喂普通饲料。STZ注射7 d后，禁食不禁水12 h，小鼠割尾采血测量空腹血糖，血糖值大于11.1 mmol/L的个体被认定为II型糖尿病小鼠。

1.2.2 自发性II型糖尿病小鼠模型

购买的4周龄的db/db小鼠，普通饲料正常喂养，至13周龄，解剖。在第4、7、9、13周检测小鼠空腹血糖值。

1.2.3 糖耐量实验

诱发性II型糖尿病小鼠成模后第4周(13周龄)，db/db小鼠第13周时，禁食不禁水12 h，腹腔注射2 g/kg体重葡萄糖溶液[6]，分别于15、30、60及120 min时小鼠割尾取血测量血糖值。

1.2.4 模型指标的测定

将13周龄的诱发性II型糖尿病小鼠、db/db小鼠及正常组小鼠眼眶静脉丛采血，分离血清。颈椎脱臼处死，解剖，取肝脏及肾脏。

(1)肉眼病变观察：肉眼观察小鼠腹腔脂肪情况、肝脏及肾脏病变情况。

(2)生化指标的测定：分离的小鼠血清，利用罗氏MODULE P800全自动生化仪测定葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(CHOL)、高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)含量。

(3)细胞因子的测定：分离的小鼠血清，采用CBA方法检测细胞因子白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-17(IL-17)、白介素-10(IL-10)的表达水平。

1.3 统计学方法

实验数据利用GraphPad Prism 5统计软件进行分析，组间比较采用t-检验方法，P<0.05时具有统计学意义。

2 结果

2.1 体重与空腹血糖变化情况

2.1.1 体重变化

从第3周开始测量小鼠体重，诱发性2型糖尿病小鼠组体重增长趋势与对照组小鼠增长趋势基本一致，且差异无显著性。db/db小鼠体重与其他组相比差异有显著性(图1)。

注: db/db小鼠与诱发性2型糖尿病小鼠比较 ** P<0.01，*P<0.05；db/db小鼠与对照组比较 ## P<0.01，# P<0.05。

2.1.2 血糖变化

分别在4周(喂高脂饲料前)、7周(注射STZ前)、9周(注射STZ 1周后)和13周(注射STZ 4周后)时，对各组小鼠进行空腹血糖检测。结果显示：在第4周时，各组小鼠血糖值均处于正常水平，组间差异无显著性。第7周时，诱发性2型糖尿病小鼠血糖值升高，个别小鼠血糖值达到11.1 mmol/L；db/db小鼠血糖值(14.9±2.5)mmol/L，与诱发性2型糖尿病小鼠相比差异有显著性。第9周时，两组糖尿病小鼠血糖值稳定维持在高血糖水平，至第13周时，两组间差异无显著性(图2)。

2.1 黑老虎林下植被主要病虫害种类及危害情况 对衡阳和怀化地区2个示范园区内苗龄1年和苗龄3年黑老虎林下植被主要病虫害展开全面调查，经过初步鉴定和统计，发现虫害18种(表1、2)病害4种(表3、4)，其中食叶害虫9种，吸汁类害虫7种，蛀干性害虫1种，地下害虫1种；病害均为侵染性病害。食叶害虫以鳞翅目居多，主要以幼虫取食叶片危害，危害严重的主要为斜纹夜蛾，危害盛发期在8月中下旬；吸汁类害虫除朱砂叶螨外，其他均属半翅目害虫，朱砂叶螨属蛛形纲叶螨科，是吸汁类害虫中危害地老虎较为严重的一种害虫，主要以成若虫在叶背面取食危害，使叶片褪绿变白，影响光合作用。病害以叶枯病危害最为严重，其次为龙纹病。

注: db/db小鼠与诱发性2型糖尿病小鼠比较，**P<0.01。

2.2 大体病变情况

2.1.1 腹腔内脂肪情况

解剖各组小鼠，打开腹腔发现：对照组小鼠腹腔内部无脂肪堆积现象；诱发性2型糖尿病小鼠腹腔内部出现肉眼可见的脂肪；db/db小鼠腹腔内脏器被大量脂肪包被(图3，彩插6)。

2.1.2 肝脏、肾脏大体病变情况

无菌解剖各组小鼠取肝脏，肾脏，肉眼观察发现：①对照组小鼠肝脏外观呈红褐色，质地软而富有弹性，边缘锐利。两组模型小鼠肝脏体积明显增大，外观呈灰黄色，边缘圆钝，质地较软脆，无弹性，切面油腻感，典型肝脂肪变现象。其中db/db小鼠属肥胖型小鼠，个体较大，肝脏体积比诱发性糖尿病小鼠更大，表面更具油腻感，且表面呈现点状(图4，彩插6)。②诱发性糖尿病小鼠的肾脏与对照组小鼠相比，肉眼观察无明显变化，基本一致；自发性糖尿病小鼠db/db的肾脏较大，个别小鼠肾脏坏死，剖开发现内部无实质，均是水样内容物(图5，彩插6)。

2.2 糖耐量测定结果

高脂饮食加STZ诱导的小鼠空腹血糖值大于11.1 mmol/L的个体被认为是成功建立的2型糖尿病模型小鼠。对诱发性的2型糖尿病小鼠、db/db小鼠及对照组小鼠进行糖耐量测试，结果显示与对照组小鼠相比，注射葡萄糖后15、30、60 min和120 min糖尿病小鼠血糖值均有显著性提高，具有统计学意义(P<0.01)，而两组模型小鼠间血糖值差异无显著性(P>0.05)。糖尿病小鼠耐糖功能低下，血糖值一直处于高水平，至120 min时仍然较高，未能回到正常水平(图6)。

注: db/db小鼠和诱发性2型糖尿病小鼠分别与对照组比较，** P<0.01。

2.3 血脂分析

检测血清显示：与对照组小鼠比较，诱发性2型糖尿病小鼠和db/db小鼠GLU、TG、CHOL、HDLC、LDLC均有升高，其中GLU、CHOL、LDLC具有统计学意义(P<0.05)；诱发性2型糖尿病小鼠TG、CHOL、HDLC、LDLC水平较db/db小鼠高，其中血清TG、HDLC、LDLC水平差异有显著性(P<0.05)(图7)。

注: 分别比较db/db、诱发性2型糖尿病和对照组小鼠，**P<0.01，*P<0.05。

2.4 细胞因子变化

注: 分别比较db/db、诱发性2型糖尿病和对照组小鼠，**P<0.01，*P<0.05。

综上所述，将两种糖尿病小鼠模型进行比较，结果显示：①两组模型小鼠的肝脏均存在病变，但差异不大；与对照组小鼠相比肝脏体积明显增大，呈现典型的脂肪肝变现象，其中db/db小鼠的肝脏更油腻。db/db小鼠的肾脏体积较大，肾脏被大量白色脂肪包被，部分个体肾脏出现坏死，剖开后内部有大量水样液体；诱发性糖尿病模型小鼠的肾脏与对照组小鼠比较，则无肉眼可见的区别。②糖耐量分析中，两组模型小鼠与对照组小鼠各时间点的血糖值均具有统计学差异(P<0.05)，耐糖功能低下；两组模型小鼠之间相比，血糖值无统计学差异。③血液生化指标中，与对照组小鼠相比，两组模型小鼠GLU、CHOL、LDLC水平明显升高(P<0.05)；两组模型小鼠相互比较，诱发性2型糖尿病小鼠血脂水平较高(P<0.05)。④免疫指标比较显示：除IL-2外，两组模型小鼠血清中细胞因子水平均较对照组小鼠明显升高(P<0.05)；db/db 小鼠血清中细胞因子表达较诱发性糖尿病小鼠高，其中IL-6、IFN-γ、TNF-α差异有显著性(P<0.05)。

3 讨论

高脂饲料喂养加上小剂量多次腹腔注射STZ是目前最常用的诱发性2型糖尿病小鼠模型的建立方法，其机制是通过高脂饮食诱导小鼠产生胰岛素抵抗，通过注射STZ 引起β细胞受损[7]。本研究结果显示：该小鼠模型虽然产生了血糖升高等类似2型糖尿病的症状，但其体型与正常小鼠体型差异无显著性，未出现肥胖现象。db /db 小鼠是由于瘦素(leptin)受体基因缺陷导致的先天肥胖性T2DM小鼠，其瘦素受体基因失去功能，在出生后2 周内就发生高胰岛素血症，3～4周发展为肥胖，8周后就发展为非常严重的高血糖症，期间伴有胰岛素抵抗，β细胞功能衰竭[8-9]，一般在8～10个月内死亡，可发生明显的肾病。两种模型小鼠均在一定程度上模拟了临床糖尿病的症状，包括高血糖、高血脂、胰岛素抵抗等，但两种模型的应用价值以及各自的优缺点却少有比较研究的报道。

2型糖尿病是一种自身免疫和低度炎症性疾病，且2型糖尿病存在着细胞因子介导的急性反应。细胞因子可通过多种机制引起炎症反应，最终引起或加速糖尿病及其并发症的发生。本研究对几个细胞因子进行了检测，结果显示不论是诱发性糖尿病模型小鼠还是自发性糖尿病模型小鼠其血清中细胞因子水平均较对照组小鼠升高，除了IL-10之外，与糖尿病临床患者的表现基本一致。两种模型小鼠中，db/db小鼠血清中细胞因子的升高更明显。

IL-10是一个主要的细胞因子合成抑制物，具有免疫抑制和免疫刺激双重作用[10-12]。IL-10作为一种抑炎因子，通过T辅助细胞下调宿主反应，抑制促炎因子TNF-α、IL-6等过度表达，并且能够控制由促炎因子引发的过度的炎症瀑布反应，并控制由此所造成的机体损害。糖尿病早期无肾病等并发症时，IL-10在炎症因素的刺激下水平升高，而随着糖尿病并发症的出现，IL-10水平下降，说明IL-10在糖尿病并发症发展过程中起保护性作用。本研究中IL-10的表达水平与临床患者结果相反，与朱英[8]等对恒河猴糖尿病模型血清中IL-10的表达情况也相反。可能是因为诱发性糖尿病模型小鼠的实验数据均采集于成模后的4周，还处于早期，未出现并发症现象。

此外，本研究发现两种糖尿病模型小鼠的肾脏有明显区别，部分db/db小鼠肾脏出现坏死，剖开后内部有大量水样液体，而诱发性糖尿病小鼠肾脏则无肉眼可见的变化，推测至糖尿病晚期也可能出现肾脏并发症，所有肉眼观察的结果还需要进一步进行病理切片来检测分析。本文中的研究还有待于进一步完善，应长期观察至小鼠死亡。

目前2型糖尿病的相关研究较多。在动物模型方面，对诱发性糖尿病小鼠模型的研究多侧重于造模方法的探讨及血脂血糖等糖尿病症状的分析[13-14]，对自发性糖尿病小鼠则侧重于生物学特性研究[15]，或不同自发性糖尿病小鼠之间的比较[16]，但对诱发性模型小鼠和自发性模型小鼠之间的比较研究较少。刘倩等[17]虽然对db/db小鼠与BALB/C诱发性2型糖尿病小鼠进行了比较，但未做细胞因子方面的研究。

无论是db/db小鼠还是诱发的2型糖尿病模型小鼠亦或是其他小鼠模型，与临床患者均存在一定的差异。与诱发性糖尿病小鼠模型相比，db/db小鼠由于其不存在人为诱导因素的干扰，糖尿病的产生与临床患者更为相似，应用价值更高。两种小鼠模型都存在一定的优点与缺陷，研究者可根据实际需要参照相关数据进行选择。

(本文图3～5见彩插6。)

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