合作小型猪T细胞受体α链的基因结构及其多样性

高建平，李玩生，曾爽，房永祥，冯海燕，杨孝朴，景志忠

(1.中国农业科学院兰州兽医研究所，家畜疫病病原生物学国家重点实验室，农业部兽医公共卫生重点实验室，兰州 730046；2.甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070)

由于猪的解剖学和生理学与人极为相似，除用于兽医学研究之外，已广泛用于人类的生理学、生物学及特有疾病的研究。但由于普通猪的体型过大，并不利于其微生物控制和实验操作，所以小型猪的培育及应用成为国内外研究的方向[1]。合作猪是我国青藏高原地区珍贵的地方品种种质资源，与目前已开发的各种实验用小型猪相比具有诸多独特的生物学特性[2]。我们实验室经过10多年对合作猪的近交培育，初步获得了3个家系的小型猪用于疫病病原致病机制研究。由于小型猪的遗传特性特别是免疫遗传学特征与抗病性关系密切，故开展了其免疫相关关键分子如T细胞受体(TCR)、主要组织相容性复合物(MHC)以及细胞因子家族等分子的基因结构研究，拟为其基础和应用研究提供依据。

T细胞是一类介导细胞免疫和调节免疫应答的关键活性细胞，其细胞表面有多种不同的标志，其中TCR作为一种细胞表面受体在获得性免疫功能中发挥着非常重要的作用[3]。多数TCR是由α、β肽链组成的异二聚体即TCRαβ。在病原抗原识别上，TCRαβ可特异地识别由抗原递呈细胞(APC)表面MHC I类或MHC II类分子呈递的抗原肽，从而启动获得性免疫反应。TCR基因具有大量的V区和一些D区以及J区,在重排的过程中,不同的组合以及结合过程中核苷酸的随机插入(N区)等可以构成大量的识别不同抗原的TCR库[3-5]。

20世纪80年代以来,TCR的研究大多集中在小鼠和人类，猪的研究很少[5-8]。随着对免疫学研究的不断深入,研究人员发现家畜如猪、牛和羊与小鼠和人类的免疫细胞在种类和组成比例上有明显的差异[9-10]，TCR作为T细胞的关键识别分子是否相同还不完全清楚。鉴于此,本研究开展了猪淋巴细胞的TCRα链基因(简称STA基因)克隆和生物学信息学分析工作,以明确合作猪TCRα链的基因结构和多样性特征，为猪病防控以及作为人类生命科学研究的动物模型提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

JM109菌种、ThermoScript TM RT-PCR kit、Trizol reagent等均购自Invitrogen公司; pGEM-Teasy载体、T4 ligase等购自Promega公司;rTaq酶、EcoR I酶、DNA片段凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒等均购自宝生物工程(大连)有限公司; DNA marker DL2000购自广州东盛生物技术有限公司;淋巴细胞分离液购自上海生工生物工程有限公司。

试验猪：本实验室【SYXK(甘)2010-0001】。近交培育的合作小型猪(F8)，3月龄1公1母。

1.2 方法

1.2.1 淋巴细胞的分离与培养

无菌采集小型猪新鲜外周血、肠系膜淋巴结和脾脏，淋巴细胞的分离、计数和培养见文献4。

1.2.2 总RNA的提取

取上述分离的细胞，用Invitrogen公司的Trizol reagent提取试剂盒提取总RNA,操作方法严格按试剂盒使用说明书进行,提取的总RNA置-70℃备用。

1.2.3 引物设计与合成

参照NCBI/GenBank上公开的猪T细胞受体α链基因序列(STA1:AB087988；STA2:AB087990)，用Oligo6.0软件在其阅读框两端设计两对特异性引物。引物序列合成如下： STA1参考序列上游引物T1：5′- TGCTTCCTGCCACTCACTCAGT-3′，下游引物T2：5′- GCGGCTGTGGTCCAGCTGA-3′； STA2参考序列上游引物：T3：5′-ATGAAGCCCACCCTCATCTCA-3′，下游引物：T4：5′-TCAGCTGGACCACAGCCG-3′。

1.2.4 RT-PCR反应

在0.5 mL PCR反应管中加入如下试剂进行反转录：RNA悬液2 μL, Oligo (dT)20 (50 μmol/L) 1 μL,10 mmol/LdNTPMix 2 μL, DEPC水7 μL,混匀后70℃预变性5 min, 瞬时离心后迅速置于冰上;然后加入5×cDNA合成缓冲液4 μL, 0.1 mol/L DTT 1 μL, ThermoScriptTMRT (15 U/μL) 1 μL, RNase-OUTTM (40 U/μL) 1 μL, DEPC水1 μL,置微量离心机离心混匀后, 55℃水浴反应45 min, 85℃灭活5 min；然后加入RNase-H (2 U/μL) 1 μL, 37℃ 20 min，反转录产物置于-20℃保存备用。

1.2.5 PCR反应

在25 μL反应体系中加入反转录产物0.3 μL, 10× buffer I 2.5 μL, 2.5 mmol/L dNTP mixture 4 μL, T1/T3上游引物和T2/T4下游引物 (50 pmol/μL)各0.25 μL,灭菌去离子水17.45 μL, rTaqDNA聚合酶0.25 μL。扩增参数为: 94℃预变性5 min; 94℃ 1 min、65～67℃ 50 s、72℃ 90 s, 35个循环后72℃延伸10 min。

1.2.6 克隆与鉴定

PCR产物经10 g/L 琼脂糖凝胶电泳,回收目的DNA片段, 与pGEM-T easy载体相连接, 转化JM109感受态细胞, 然后涂布含氨苄青霉素(100 μg/mL)的平板,挑取单个菌落,接种LB中37℃振摇培养过夜,提取的质粒经凝胶电泳及EcoRI酶切鉴定后，送上海生物工程有限公司测序。

1.2.7 生物信息学分析

利用SignalP 3.0 Server-prediction、DNAStar、SMART、IMGT/V-QUEST等生物软件, 应用生物信息学方法对克隆分子的遗传演化关系和序列结构进行预测分析。

2 结果与分析

2.1 STA基因的扩增与序列分析

将STA1和STA2参考序列的特异性引物扩增的产物进行电泳分析，结果均可见在750 ～1000 bp之间出现一条特异性扩增条带(图1、图2)。将克隆片段的阳性质粒测序，所得的基因序列通过与参考序列的比对以及BLAST的同源性搜索后确定，克隆的93个基因序列为猪T细胞受体α链基因，统一命名为STA1-STA93，其中基因克隆STA1-STA68来自猪外周血淋巴细胞，STA69-STA78来自猪肠系膜淋巴结，STA79-STA93来自脾脏淋巴细胞。

将93个基因序列整体分析发现，其中79个序列含有较大的完整的开放阅读框，14个序列只含一个较小的开放阅读框，这些阅读框较小的序列主要扩增自猪外周血和脾脏的淋巴细胞。

注：1.DNA分子质量标准；2.猪外周血STA1 PCR 产物；3.猪淋巴结STA1 PCR 产物；4.猪脾脏STA1 PCR 产物。

注：1.DNA分子质量标准；2.猪外周血STA2 PCR 产物；3.猪淋巴结STA2 PCR 产物；4.猪脾脏STA2 PCR 产物。

2.2 STA基因的同源性比较

利用DNAStar和MEGA等软件进行同源性分析发现，STA1～93基因间核苷酸的同源性在68.4%～98.7%之间(见STA1～16分析表1，其他略)。根据核苷酸同源性比对结果，将STA1～5、STA11、STA13～18、STA20、STA23～25、STA27～28、STA46～68、STA91～STA93归为一亚类，将其余的49个基因序列再归为一亚类，分别命名为STAI和STAⅡ(图略)，这与所用的STA1和STA2特异性引物扩增无关。

2.3 STA基因的基本结构与多样性分析

对分类的STA I和STA II基因的全长通过对比分析发现，STA I类基因除STA43和STA85基因之外(以下均不包括这两个基因)，基因序列在第1～320位差异比较小，这一位置主要包括基因的信号肽、FR1区、CDR1区、FR2区、CDR2区和FR3区前部分，为TCRα链的V区的绝大部分序列。基因间序列的主要差异集中在第320～400位，这一位置包括FR3区后部分和CDR3区，主要为TCRα链的V区的小部分序列和整个J区。第401位以后相对比较保守，为TCRα链的C区。

表1 STA1～16基因核苷酸序列同源性比较

对于STA I类基因，在信号肽区(约1～57位)发现有两个主要变异位点。在FR1区和CDR1区(约第58～150位)，发现有11个变异位点，这一区域主要变异热点在STA3、17、20、27、91等基因序列。FR2区 和CDR2区(约第151～250位)发现8个变异位点。FR3区和CDR3区(约第251～400位)序列的差异很大，后面将作详细分析。C区(第401～825位)相对比较保守，有21个变异位点。

STA II基因结构分区与STA I类基因基本相似。将这49个基因的核苷酸序列比较发现，STA22和STA74与其他47个基因的核苷酸序列不同，在其第45～59位间多了14 bp的碱基(ATCTTTCTTTTCTA)。对除这两个基因之外的47个基因的分析发现：在信号肽区(约第1～57位)主要有5个变异位点。在FR1区和CDR1区(约第58～150位)，发现主要有6个变异位点。这一组基因的FR2区和CDR2区(约第151～250位)变异点比较集中，主要分布在第166位，另外有17个基因在169～170位多了AT两个碱基。同样FR3区和CDR3区(约第251～420位)序列的差异很大，后面将作详细分析。这类基因的C区(第401～825位)也比较保守，有16个变异位点。

2.4 STAV序列与人类TRAV的相似性比较

在核苷酸水平，对STA1～93基因V区(STAV)用IMGT/V-QUEST软件与其数据库中的人类TRAV基因序列进行同源性分析，发现STAV1、2、3等39个基因与人类TRAV16*01的相似性最高，均在80%以上。STAV6、7、10等34个基因与人类TRAV18*01的相似性较高，在75%以下。STAV8等13个基因与TRAV8-4*07相似性较低，均在65%以下。

在氨基酸水平，将克隆的93个STAV推导编码的氨基酸序列与IMGT中的人类TRAV的进行相似性比对，发现与人类相似性最高的序列为TRAV16*01、TRAV18*01、TRAV8-4*01(表2)。选择代表性的STAV1、STAV6、STAV21分别作相似性分析发现，STAV1与 TRAV16*01相似性为84.67%，STAV6 与TRAV18*01相似性为73.3%，STAV21与 TRAV8-4*01相似性为60.22%(图3～5)。

2.5 STAJ序列与人类TRAJ的相似性比较

同样将88个含有猪STA基因JUNCION区(即连接区，简称STAJ)的序列与人类的TRAJ进行同源性比较，发现与人类TRAJ序列同源性达85%以上的STAJ序列有23个，其中最高可达92.54%。88个STAJ序列按相似度对应人类TRAJ的有43个，一种人类TRAJ如TRAJ10*01、24*02、36*01和48*01对应的STAJ序列最多为5个，并且对应同一TRAJ序列如TRAJ10*01的STAJ间的相似度很高，但并不完全相同。对照STAV序列的相似度分析发现，与STAV序列对比结果不同的是STAJ序列分散度很大，两者并无相关性，这可能与人类V区和J区的分子结构组成机制不同有关(表2，3)。

在氨基酸水平上，对88个STAJ序列进一步分析发现，这些序列的J区绝大部分能形成正常阅读框(in-frame)，一般由9～18氨基酸组成。序列除前两个氨基酸均为半胱氨酸和丙氨酸，最后一个氨基酸主要为苯丙氨酸外，其他氨基酸均有非常复杂的多态性变化，这一分析结果与人类TRAJ的结果相一致(表2)。

表2 STA1～50基因V区、J区推导氨基酸序列及与人类的分子结构特征比较

图3 STAV1序列与人的TRAV16*01相似性分析

图4 STAV6序列与人的TRAV18*01相似性分析

图5 STAV21序列与人的TRAV8-4*07相似性分析

3 讨论

3.1 猪TCRα链基因的基本结构与多样性

根据GenBank上登录的猪T细胞受体α链的基因序列设计引物，采用RT-PCR技术利用两对特异性引物从小型猪外周血、脾脏和淋巴结的淋巴细胞中成功扩增和克隆鉴定了猪TCRα链基因STA1～93，而且每个基因序列各不相同，绝大部分基因显示了丰富的多态性和多样性。除扩增的较小片段基因序列(缺失V区)外，全长ORF的基因序列都含有一个可变的V区、高变的J区和恒定的C区基因结构，并能形成与pMHC复合物结合的CDR1、CDR2和CDR3关键结构域，这符合TCR基因的谱系发育、基因重排和分子结构组成特征[4,6,7]。

表3 STAJ序列与人类TRAJ的相似性比较

同时，对全长ORF的STA基因的核苷酸序列的信号肽区、FR1区、CDR1区、FR2区、CDR2区、FR3区和CDR3区进行分区比对发现，还存在非常复杂的多态性和多样性。其中大多数变异位点多集中于CDR3区和接近这一功能区的FR3区，其他区域相对较少，这与Arden等[7]的分析结果一致。这些区域序列的变异位点大部分属于等位基因的多态性，而CDR3区和接近这一功能区的FR3区的大量变异位点属于TCR多样性的具体体现，这与TCR基因重排或非模板的随机插入特性相关，由此也充分表明了猪TCRα链的多样性特征[11-12]。

3.2 猪TCRα链分子与人类的遗传演化关系

STA1～93基因V区分别与人类TRAV基因的同源性分析发现，STAV1、2、3等39个基因与TRAV16*01相似性在80%以上，STAV43和STAV85与TRAV2*01和TRAV2*02相似性在80%以上，STAV6、7、10等34个基因与TRAV18*01相似性在70%以上，STAV8等13个基因与TRAV8-4*07和TRAV8-4*06也有较大的相似性，说明猪TCRα链V区与人类的遗传演化关系较近。因此，可依据Yamamoto等[8]的人类TRA的分类方法，将克隆鉴定的93个STA基因归类。

T细胞受体α链的J区是其变异程度最大的区域，也是CDR3区形成的最关键的部位，STAJ与人类TRAJ的相似性比较更能体现其遗传演化关系。STAJ推导编码氨基酸的相似性比较发现，虽然不同STAJ间序列差异性很大，但在88个STAJ序列中按相似度对应人类TRAJ序列有43个，其相似性均在70%以上，甚至高达92.54%。这说明STAJ序列虽然在物种内多样性丰富，但在遗传上还与人类的TRAJ关系密切。

3.3 猪TCRα链分子的结构与生物学功能关系

TCRαβ 作为T细胞识别和结合由抗原递呈细胞(APC)递呈的MHC-抗原肽分子的重要表面受体，主要由保守的框架区 (FRs)和多态性的互补决定区(CDRs)组成。由V基因片段编码的CDR1和CDR2主要负责与MHC分子结合，而由V-(D)-J 编码的CDR3主要负责结合抗原肽。已证实人类TCRα链 V基因成分由44～46 个功能性的TRAV组成[13]，绒猴(Callithrixjacchus) 的TCR α链由1个恒定的C、46个J和35个V基因片段组成[14]。Yamamoto等[8]首次报道扩增了103个完整的猪TRA cDNA，其中含33个不同的TRAV基因，后根据人类TRAV基因将其归类为20个亚类，其中13个亚类只含一个成员，最多的亚类含12个成员。目前，我们已克隆鉴定猪TCRα链基因93个，而且每个基因各不相同，但猪TCRα链究竟由多少个V、J和C基因片段组成，还不能确定。但可以肯定是，合作小型猪TCRα基因具有十分丰富的多态性和多样性，能够适应外界复杂环境的免疫学反应需要。

[1] 商海涛, 魏泓.我国小型猪品系资源状况初浅分析 [J].中国实验动物学报, 2007, 15(1): 70-75.

[2] 景志忠, 张永兴、高世杰, 等.甘肃蕨麻猪实验动物化利用前景 [J].实验动物科学与管理,1997, 14(4): 64-65.

[3] 何维.医学免疫学 [M].北京：人民卫生出版社, 第二版, 2010.8.

[4] 冯海燕, 莫斯科, 房永祥, 等.猪T细胞受体α链基因的克隆、序列分析及其结构预测 [J].华北农学报, 2010, 25(1): 23-29.

[5] Schatz DG, Ji YH.Recombination centres and the orchestration of V(D)J recombination [J].Nature Rev/Immunol, 2011, 11: 251-263.

[6] Hedriek SM, Cohen DI, Nielsen EA, et al.Isolation of cDNA clones encoding T cell-specific membrane-assoeiated proteins [J].Nature, 1984, 308: 149.

[7] Arden B, Clark SP, Kabelitz D, et al.Human T-cell receptor variable gene segment families [J].Immimogenetics, 1995, 42(6):.455-500.

[8] Yamamoto R, Uenishi H, Hatsuse H, et al.TRAV gene usage in pig T-cell receptor alpha cDNA [J].Immunogenetics, 2005, 57: 219-225.

[9] Gerner W, Kaser T, Saalmuller A.Porcine T lymphocytes and NK cells -an update [J].Dev Comp Immunol, 2009, 33:310-320.

[10] Ishiguro N, Tanaka A, Shinagawa M.Sequence analysis of bovine T-cell receptor α chain [J].Immunogenetics, 1990, 31: 57-60.

[11] Walchli S, Løset GA, Kumari S.A Practical Approach to T-Cell Receptor cloning and expression [J].PLoS ONE, 2011, 6(11): e27930.

[12] Boudinot P, Marriotti-Ferrandiz ME, Du Pasquier L, et al.New perspectives for large-scale repertoire analysis of immune receptors [J].Mol Immunol, 2008, 45: 2437-2445.

[13] Scaviner D, Lefranc MP.The human T cell receptor alpha variable (TRAV) genes [J].Exp Clin Immunogenet, 2000, 17(2): 83-96.

[14] Fujii Y, Matsutani T, Kitaura K, et al.Comprehensive analysis and characterization of the TCR α chain sequences in the common marmoset [J].Immunogenetics, 2010, 62: 383-395.