明视野显微镜下特异性区分斑马鱼视网膜细胞核的方法

付金玲，宋 丹，左 玲，邹 贺，康治臣

(吉林大学第二医院 1.眼科；2. 康复科，吉林 长春130041)

精确地计数视网膜细胞在时间和空间上的分布是研究视网膜发育及退变的基础。每个视网膜细胞只有一个细胞核，因此最直接计数视网膜细胞的方法是在光学显微镜下计数细胞核的数目。然而，由于视网膜的高核密度使直接核计数非常困难。这主要是源于光学显微镜垂直分辨率比水平分辨率低[1，2]。在明视野显微镜下精确地计数特定视网膜区域细胞分布情况的前提是能够特异并敏感地染色薄组织切片细胞核。

上述需要可以通过整合JB-4塑胶树脂包埋及福尔根反应所完成。JB-4包埋基于乙二醇甲基丙烯酸酯聚合反应[3-7]。因为聚合发生在单体的试剂渗透入生物样本之后，因此JB-4包埋能够很好地保持样本形态。而且JB-4包埋后的组织非常坚硬，最薄可以得到0.5 μm的组织切片[8]。

目前主要使用四个基本类型的染料和试剂染色细胞核，它们分别是基于静电结合、水解反应、共价修饰以及免疫反应的原理[9]。由Feulgen和Rossenbeck[10]发明的福尔根核染色方法，是基于Schiff试剂和醛基之间的一个共价反应。

本文主要内容是结合JB-4塑胶树脂包埋和福尔根染色的方法来观察斑马鱼视网膜细胞核。通过分析JB-4切片厚度、盐酸水解程度及Schiff反应条件对细胞核染色的影响，寻找一个最佳能够敏感且特异染色斑马鱼视网膜细胞核的方法。

1 材料与方法

1.1 斑马鱼饲养

AB和TU野生型斑马鱼在14 h光照/10 h黑暗交替循环的恒温鱼房培育饲养。

1.2 方法

1.2.1 眼球固定、JB-4包埋及切片 在常温下过夜固定野生型斑马鱼成鱼眼球，JB-4包埋(Polysciences公司)，仔细观察并不断调整组织以达到正确的包埋方向，为判定不同切片厚度对细胞核观察的影响，将JB-4包埋的组织用超薄切片机(Thermo Electron公司)切片，每个组织切片厚度分别为2 μm、3 μm、4 μm及6 μm。

1.2.2 福尔根染色 为找到最佳的盐酸水解条件(浓度和时间)、Schiff反应时间及洗涤耐受时间，分别进行如下实验：

①在常温下将JB-4切片分别浸泡于装有1N、2N、3N、4N及5N盐酸的科普林氏玻片染色缸中，浸泡持续时间从30 min到过夜。将染色后的切片浸泡于蒸馏水中洗涤10 min去除剩余未水解的盐酸。在常温下将切片浸泡于Schiff试剂(Santa Cruz公司)中2 h。②将经过3N盐酸过夜处理的切片浸泡于Schiff试剂中30 min到5 h。③将经过3N盐酸过夜处理、Schiff试剂浸泡2 h的染色切片用流水冲洗30 s，再分别浸泡于蒸馏水中洗涤5 min、30 min及过夜。④将洗涤过的切片常温空气中干燥，盖玻片下中性树胶封片。

1.2.3 亚甲天蓝II和核固红染色 ①将2 μm厚的JB-4切片分别在常温下浸泡于亚甲天蓝II(Sigma-Aldrich公司)和核固红(Trevigen公司)溶液中30 min。②为去除过量的染料，染色后的切片于常温下用流水冲洗30 s并置于蒸馏水中分别脱染5 min、30 min及过夜。③洗涤过的切片常温空气中干燥，盖玻片下中性树胶封片。

1.2.4 明视野显微镜 使用奥林巴斯BX60显微镜PlanApo 60×/1,40和UplanApo 20×/0,80油镜观察结果，所有图像均在同一暴露时间下用4.6版Spot软件拍摄。每一种染色方法至少有10张不同的样本被拍摄，然后经肉眼筛选出可代表这一特定染色方法的图片。

2 结果

2.1 福尔根染色盐酸水解条件

福尔根染色盐酸水解可以在多种条件下进行。为找到适合于JB-4包埋的斑马鱼视网膜福尔根染色的最佳盐酸浓度，将4 μm厚的JB-4切片在Schiff试剂处理之前分别用1N、2N、3N、4N及5N的HCl进行不同时间的水解反应。然后通过肉眼观察粉红色的深浅判断福尔根染色程度。我们发现盐酸浓度越高、浸润时间越长，则染色程度越强；反之，盐酸浓度越低、浸润时间越短，则染色程度越弱。但低浓度的盐酸可以通过延长浸润时间而提高染色强度。因此，为满足快速水解的需要，推荐将JB-4包埋的组织切片浸润于5N盐酸中45 min。另外，3N盐酸过夜处理也足以获得相同的染色效果。

2.2 福尔根染色Schiff反应时间

Schiff 反应是醛基与Schiff试剂之间的共价凝集反应，Schiff反应的持续时间也会影响粉红色终产物的数量。因此，我们比较了3N盐酸过夜处理的4 μm厚JB-4切片经过不同时间Schiff浸润后染色强度的变化。我们发现染色强度随着Schiff浸润时间的延长而增加，2 h染色最强。

2.3 切片厚度对细胞核可分辨度的影响

通过比较2 μm、3 μm、4 μm及6 μm厚的切片对福尔根染色及核边界分辨度的影响，发现这三类切片的染色强度均足以看清视网膜各类细胞核。然而，切片越厚，相互重叠的临近细胞核越多以致单个细胞核越难分辨(图1A-D)。考虑到在切2 μm厚切片时，标本经常破碎，推荐使用3 μm厚切片以区分单独的细胞核及观察组织整体形态。

图1组织切片厚度对细胞核可分辨度的影响。(A-D)在2μm组织切片(A)中单个细胞核比在3μm组织切片(B)、4μm组织切片(C)及6μm组织切片(D)中显示出更清晰的核边界。箭头所指显示临近的细胞核相互重叠。(60×)

2.4 福尔根染色与亚甲天蓝II、核固红染色的区别

亚甲天蓝II和核固红是阳离子染料，它们通过与带负电荷的分子间静电结合而使组织染色。因为DNA分子是带负电荷的，因此这两种方法经常用于染细胞核。但它们也能使其它带负电荷的细胞质分子染色，因此特异性低。通过比较2 μm厚的JB-4切片福尔根染色与亚甲天蓝II及核固红对细胞核的染色，发现亚甲天蓝II及核固红均产生很强的非特异性细胞质染色，很难分辨单一的视网膜细胞核。由于视锥细胞核本身染色弱，使得区分视锥细胞核染色及细胞质染色变得更加困难。我们试图通过增加脱染时间而减弱细胞质染色背景。但过度的脱染洗涤时间并不奏效，因为这样既减弱了细胞核信号又减弱了细胞质信号。实验结果显示经过30 min洗涤后细胞核和细胞质染色均变得非常微弱；过夜洗涤后，染色几乎完全消失。而相比之下，共价反应的福尔根细胞核染色可耐受过度的洗涤。因此，尽管福尔根染色操作相对需要更长时间，但它较亚甲天蓝II及核固红染色更特异及稳固。

3 讨论

福尔根染色是基于两个基本的化学反应[11,12]。首先，盐酸水解打破DNA分子碱基与脱氧核糖之间的结合，从而在脱氧核糖的一端生成了醛基。其次，DNA水解产生的醛基与Schiff试剂发生凝集反应产生粉红色含有醌基的化合物，粉红色化合物的多少与DNA分子的数量密切相关[11-13]。当生物样本包埋于JB-4塑胶树脂中，JB-4基质将阻止化学试剂的渗透从而减慢以上所述的化学反应。因此，与薄切片相比，尽管厚的JB-4切片包含更多的DNA，但对于福尔根染色而言，化学反应的减少表明染色强度可能不和切片厚度成正比。除此之外，厚切片由于光学显微镜垂直分辨率的局限性会破坏图像质量[1]。因此，为了更好地观察斑马鱼视网膜细胞核，需要寻求一个染色信号强度与图像分辨率之间的平衡。综上，我们系统地研究了盐酸水解、Schiff反应及JB-4切片厚度如何影响斑马鱼视网膜细胞核的福尔根染色。

通过以上实验结果，我们得出了一个最佳福尔根染色方法。它可以用于观察JB-4包埋的斑马鱼视网膜细胞核及组织形态。方法如下:①在常温下固定斑马鱼眼球于4%多聚甲醛溶液中过夜。②将固定后的眼球包埋于JB-4 树脂中。③3 μm厚的切片用于观察细胞核整体结构。④收集切片于载玻片上。⑤在常温下将JB-4切片经3N盐酸过夜处理或5N盐酸浸润45 min以水解DNA 分子。⑥将切片用蒸馏水洗涤10 min以去除过多的盐酸。⑦在常温下将经盐酸水解的JB-4切片于Schiff试剂中浸润2 h。⑧将切片用流水冲洗30 s，再用蒸馏水洗涤5 min以去除过多的Schiff试剂。⑨盖玻片下中性树脂封片，显微镜照相。

这个简单可靠的染色方法可以用于细胞计数。

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