EGF与Gastrin联合应用对糖尿病大鼠胰岛β细胞再生的影响

孟召祥，孙中华，张媛媛，刘静秋，杨 丽，高 静，倪劲松*

(1.吉林省人口生命科学技术研究院，吉林 长春130041；2.吉林大学第一医院 内分泌科；3.吉林大学人兽共患病教育部重点实验室人兽共患病研究所；4.吉林省产品质量监督检验院；5.吉林大学第一医院 病理科)

表皮生长因子(EGF)是肽类生长因子，许多研究证明，EGF参与体外诱导干细胞向胰岛样细胞分化。已有文献证实Gastrin是一种介导胰岛新生的生长因子[1]，观察转导胰岛素启动子调控Gastrin基因的小鼠，虽然没有观察到实验组小鼠胰岛细胞数量的变化，但表达TGF、Gastrin的胰岛细胞数增多。在大鼠的胰腺导管结扎模型中发现Gastrin可促进胰岛β细胞再生，推测可能在该模型中，外源性的Gastrin可能是促进胰岛β细胞再生必要因子[2]。本文通过联合应用Gastrin、EGF，观察Gastrin、EGF对糖尿病大鼠胰岛β细胞增殖作用影响。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和设备

STZ和Heochest33342为Sigma公司产品；兔抗PDX-1抗体为Santa Cruz公司产品；鼠抗Insulin抗体为北京博奥森公司产品；Alexa Fluor 555标记的山羊抗兔IgG 和Alexa Fluor 488标记的山羊抗鼠IgG、EGF为 Invitrogen 公司产品；Insulin为江苏万邦生化医药有限公司产品；Gastrin为GenScript Corporation产品；Fluview 1000激光扫描共聚焦显微镜为Olympus公司出品，切片机为德国Leica公司。

1.2 糖尿病大鼠模型的建立

Wistar雄性大鼠45只，体重180 g-220 g，随机分成2组，正常对照组10只，实验组35只。给予正常对照组大鼠腹腔注射pH4.0枸橼酸钠缓冲液，对实验组大鼠进行腹腔注射STZ-枸橼酸钠缓冲液，注射剂量为35 mg·kg-1，每周1次，连续4周。所有大鼠按时尾静脉采血测血糖，根据血糖值≥ 11.1 mmol·L-1及尿糖≥ +++确定成模标准。

1.3 实验分组

将实验组成模大鼠随机分为三组，即：Insulin治疗组10只，给予长效胰岛素2U/d，连续14日；EGF/Gastrin联合治疗组10只，皮下注射EGF(1 μg·kg-1) /Gastrin (3 μg·kg-1)，连续14日；DM对照组9只，对 DM对照组和正常对照组，均给予pH8.0 Tris-HCl缓冲液，实验结束后留取胰腺标本进行实验观察。

1.4 免疫荧光双染色

常规免疫组化制片，用5%山羊血清封闭30 min，滴加一抗组合，过夜(PDX-1与Insulin)，0.01%Triton洗3遍，每次洗涤5min，滴加双二抗(Alexa Fluor 555标记的山羊抗兔IgG 和Alexa Fluor 488标记的山羊抗鼠IgG)，常温下避光放置1 h，0.01% Triton洗3遍，5 min/次，Hoechest复染核，PBS洗1次，10 min甘油封片。

1.5 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件对实验数据进行统计学分析，将各组间数据根据单因素方差分析方法比较后，使用q检验，当P<0.05认为有统计学差异。

2 结果

2.1 糖尿病大鼠血糖变化

实验组35只大鼠中，33只大鼠血糖值≥11.1 mmol·L-1，占总数的约94%，其中，29只实验组大鼠的空腹血糖值为15.6±3.01 mmol·L-1，与正常对照组相比明显增高。

2.2 EGF/Gastrin联合应用对糖尿病大鼠血糖的影响

DM组大鼠血糖值随时间推移变化比较大，平均值为20.3±3.78 mmol·L-1，最高值26.1 mmol·L-1。胰岛素组10只大鼠的平均血糖值8.0±4.38 mmol·L-1，有8只大鼠血糖值低于11.1 mmol·L-1，其中6只大鼠血糖值低于7.8 mmol·L-1，与模型组相比有明显降低(P<0.05)。EGF/Gastrin组中平均大鼠血糖值11.2±6.43 mmol·L-1，有6只大鼠血糖值低于11.1 mmol·L-1，其中有5只大鼠血糖值低于7.8 mmol·L-1。EGF/Gastrin组大鼠的血糖值和DM组大鼠的血糖值相比可见显著降低(P<0.05)，但是仍高于正常对照组和胰岛素组(表1)。

2.3 PDX-1在胰腺组织中的表达及与Insulin表达的关系

对胰岛组织进行了PDX1和Insulin染色。结果发现，在正常对照组中，PDX-1阳性表达在胰岛部分β细胞的细胞核中出现。DM组大鼠胰岛仅见微量Insulin和PDX-1表达。EGF/Gastrin治疗组和Insulin治疗组在胰岛组织的周边见PDX-1阳性细胞，并存在PDX-1与Insulin共表达的细胞。与正常的β细胞相比，这些PDX-1阳性细胞的Insulin着色较弱(图1)。

表1 实验大鼠实验结束后的空腹血糖值

注：DM组在处死前有1只大鼠死亡；*DM组与正常对照组相比；**Insulin组与DM组相比；***EGF/Gastrin组与DM组相比。

3 讨论

以往的研究证实，在胰腺发育过程中EGF起一定作用，并且发现大鼠胚胎胰腺导管能被EGF受体信号促进生成[3]，胰腺导管形成过程受破坏或胰岛细胞分化障碍是由于EGF受体缺乏导致的[4]。在胰腺发育中的次级转变时期出现有活性的内源性Gastrin的表达[5]。在实验中我们进行研究的对象为血糖值≥11.1 mmol/L的糖尿病大鼠，持续给以外源性Gastrin和EGF，观察二者联合应用对糖尿病大鼠胰岛β细胞再生的影响。

A.为正常组；B.为DM组;C.为Insulin治疗组;D.为EGF/Gastrin治疗组Insulin的绿色荧光染色位于细胞质；PDX-1的红色荧光染色位于细胞核

PDX-1是目前较为公认的胰岛前体细胞分子标志，是胰腺定向发育成熟过程中第一个已知的也是最为重要的转录因子。PDX-1能促进胰岛β细胞增殖并抑制细胞凋亡，通过调控Insulin和Insulin相关基因，用来促进Insulin的分泌以维持胰岛β细胞的正常生理功能。为了确定增多的β细胞数量是否是β细胞增殖的结果，我们检测了EGF/Gastrin组大鼠的胰腺的β细胞中的的PDX-1蛋白表达。我们的实验结果证实胰岛中增多的β细胞并不是残存的β细胞增殖所形成的，而是由其它的细胞再生分化的结果。胚胎发育时期，胰腺导管细胞转变为胰岛β细胞是由PBX与PDX-1基因共同作用来促进的。胰腺大部分被切除后，PDX-1表现显著促胰腺细胞增殖的作用，该表现类似于胚胎发育的胰腺形成过程[6]。我们在实验中观察到，EGF/Gastrin组大鼠的胰腺出现了共表达胰岛素细胞，胰岛周边存在PDX-1阳性细胞。这些细胞胰岛素表达比正常β细胞弱、显颗粒状、荧光强度较弱。推测这些细胞是处于由胰岛前体细胞向胰岛素分泌细胞分化过程中。我们给予外源性Insulin及EGF与Gastrin联合进行治疗后大鼠血糖明显降低，且部分血糖恢复到正常水平。治疗后PDX-1胰岛素前体细胞在大鼠胰岛组织中表达，且这些细胞能表达胰岛素，表现向胰岛素分泌细胞分化的趋势。但EGF与Gastrin对β细胞再生的影响，是否是EGF和Gastrin直接作用导致了胰岛前体细胞的出现并促使其发生分化，亦或是通过降低血糖而间接发挥作用尚无法确定。另外，有关EGF与Gastrin促进β细胞再生是通过胰岛内细胞化生,还是来源于胰腺导管中存在的胰岛前体细胞，有待进一步的研究证实。

参考文献：

[1]Téllez N,Joanny G,Escoriza J,et al.Gastrin treatment stimulates β-cell regeneration and improves glucose tolerance in 95% pancreatectomized rats[J].Endocrinology,2011,152(7):2580.

[2]Brand SJ,Tagerud S,Lambert P,et al. Pharmacological treatment of chronic diabetes by stimulating pancreatic beta-cell regeneration with systemic co-administration of EGF and gastrin[J].Pharmacol Toxicol,2002,91(6):414.

[3]Sjöholm A,Sandberg E,Ostenson CG,et al.Peptidergic regulation of maturation of the stimulus-secretion coupling in fetal islet beta cells[J].Pancreas,2000,20(3):282.

[4]Miteeinen PJ,Huotari M-A,Koivisto T,et al.Impaired migration and delayed differentiation of pancreatic islet cells in mice lacking EGF-receptors [J].Development,2000,127:2617.

[5]Brand SJ,Fuller PJ.Differential gastrin gene expression in rat gastrointestinal tract and pancreas during neonatal development[J].Biol Chem,1988,263:5341.

[6]孙吉平,杨于嘉,王晓莉,等.胰腺十二指肠同源框-1基因促进大鼠骨髓间充质干细胞分化为胰岛样细胞[J].中国科学 C辑 生命科学,2006,36(2):171.