肾复康Ⅱ号抗肾间质纤维化及对人肾上皮小管细胞转分化的作用＊

史 健 杨洪涛 胡 锐 刘建红 程小红 陕西省中医医院肾病科 （西安 710003）

肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis，RIF）是所有慢性肾脏疾病进行性发展的共同通路，是导致终末期肾衰竭的主要病理基础。上皮细胞向肌成纤维细胞（myofibroblast，Myof）的转分化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是参与肾小管间质纤维化的重要机制之一[1]。EMT受多种细胞因子、生长因子和激素的调节，其中转化生长因子－β1（TGF-β1）是最重要的促纤维化因子，主要通过Smads信号通路诱导其下游因子表达，启动并调节EMT的全过程[2]。在TGF-β1作用下，肾小管上皮细胞表型转变及成纤维细胞活化增殖后均可表达α－SMA，α-SMA表达阳性的细胞是慢性肾脏疾病进展至终末期肾衰过程中起关键作用的细胞，人肾组织研究中发现肾脏间质内α-SMA表达量与肾间质纤维化的程度以及肾功能恶化程度呈正相关关系[3]。

我们在临床上用肾复康Ⅱ号治疗慢性肾衰竭，可以改善患者的临床症状，防治肾间质纤维化的发生发展。本研究应用肾复康Ⅱ号对单侧输尿管结扎（unilateral ureteral obstruction，UUO）诱导的肾间质纤维化大鼠模型进行干预性治疗，观察其抗肾脏组织纤维化的作用；观察肾复康Ⅱ号含药血清对TGF-β1所诱导的人肾小管上皮（HK-2）细胞平滑肌肌动蛋白（a-SMA）表达的影响 ，初步探讨肾复康Ⅱ号防治肾间质纤维化的机理。

1 实验材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 药物与试剂：肾复康Ⅱ号胶囊由山萸肉、菟丝子、金樱子、仙灵脾、醋鳖甲、王不留行、姜黄、赤芍等12味中药组成（由陕西中医医院提供，陕西省药品监督管理局批准院内制剂，每粒0.3g），百令胶囊（杭州中美华东制药），DMEM／F12培养基、Triton X-100（Gibco）；胎牛血清（HyClone）；BCA蛋白定量试剂盒、蛋白酶抑制剂、蛋白Marker、ECL化学发光底物（Pierce）；细胞裂解液、丙烯酰胺、Tris-Base、TEMED、十二烷基硫酸钠、甘氨酸、丽春红、硝酸纤维素膜（Amresco），鼠抗人a-SMA多克隆抗体（博士德生物），脱脂奶粉（完达山乳业）。10%水合氯醛、盐水、碘伏、酒精、注射用青霉素钠等。

1.1.2 实验动物与细胞：选用清洁级雄性SD大鼠180只，体重200±20g，由第四军医大学动物实验中心购进（2007-007），适应性喂养1周，随机分组，动物室温度22～25℃，湿度68～72%，颗粒饲料喂养，自由饮水和自然昼夜节律光照。人肾小管上皮HK-2细胞由第四军医大学西京医院肾脏内科孙世仁教授惠赠。

1.2 仪 器 莱卡肾脏组织平推式切片机（LeiCASM2000R），莱卡冰冻切片机（LeiCACM1850），国产石蜡包埋机（雅博）、烤片机（LeiCAHI1220），日本奥林帕斯显微镜（OlympusBX 41），病理图像分析软件系统（HMIAS-2000），二氧化碳培养箱（CB150，德国宾德），超净工作台（SW-CJ-2FD，苏州净化设备有限公司），酶标仪（POLARstar OPTIMA，BMG Labtechnologies），倒置显微镜（尼康 E200），25cm2培养瓶，12，48，96孔板培养板（美国COSTAR公司），紫外分光光度计（UV1102，上海天美），离心机（L-530，赛特湘仪），电热恒温培养箱（GNP-9162，上海跃进医用光学器械厂），电泳槽（DYY-Ⅲ型）、电泳议（DYY-7C型）（北京六一），凝胶扫描成像系统（Gel DOC2000）。

1.3 方 法

1.3.1 肾复康Ⅱ号对肾间质纤维化大鼠模型的干预作用：大鼠适应1周后采用输尿管结扎方法[3]造模，术后常规肌肉注射青霉素3d。将90只大鼠随机分成5组，平均每组18只。假手术组，模型组，小剂量组：肾复康Ⅱ号胶囊2.25g／kg·d，中剂量组：肾复康Ⅱ号胶囊4.5g／kg·d，大剂量组：肾复康Ⅱ号胶囊9g／kg·d。将肾复康Ⅱ号胶囊以温开水溶解后制成混悬液，于造模手术后1d开始给予以上剂量组大鼠灌胃，灌胃容积为1mL／100g，假手术组及模型组给予同体积的蒸馏水灌胃。分别于灌胃后第7d、第14d、第21d各组处死6只大鼠，剖取右肾组织块以10%福尔马林-PBS溶液固定，常规石蜡包埋切片，HE染色，光镜200倍放大，光镜下观察肾间质和肾小管的病变程度。以Masson染色光镜下观察不同时间段肾脏间质纤维化的面积。

1.3.2 肾复康Ⅱ号含药血清对TGF-β1所诱导的人肾小管上皮（HK-2）细胞平滑肌肌动蛋白（a-SMA）表达的影响：含药血清的制备：90只大鼠随机分为3组。肾复康Ⅱ号胶囊、百令胶囊以温开水溶解后制成混悬液，肾复康Ⅱ号胶囊9g／kg·d，百令胶囊0.27g／kg·d给大鼠灌胃，空白组等体积的生理盐水灌胃，灌胃容积为1mL／100g，连续7d。末次给药后2h，水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，分离血清，每组含药血清混合，过滤除菌，并置于56℃水浴箱中灭活30min，-20℃冰箱保存备用。

细胞培养及分组：HK-2细胞置于含10%经灭活胎牛血清的DMEM／F12培养基中，37℃、5%CO2温箱培养。将对数生长期的HK-2细胞用0.25%胰酶消化成单细胞悬液，密度调至105细胞／mL，转入培养瓶，待细胞长满至约80%的融合状态时改用无血清DMEM／F12培养基同步饥饿24h，使细胞进入静止期。24h饥饿同步后分为6组：①无血清对照组；②大鼠血清组（10%）；③TGF-β1（5ng／mL）组；④TGF-β1（5ng／mL）＋百令鼠血清组 （10%）；⑤TGF-β1（5ng／mL）＋大剂量含药鼠血清组（10%）；⑥TGF-β1（5ng／mL）＋中剂量含药鼠血清组（5%），各组均加入无血清DMEM／F12培养基5mL。细胞孵育48h后4℃PBS洗涤，裂解细胞，离心，蛋白定量，沸水加热变性。

免疫印迹法检测a-SMA的表达：GAPDH作为内参，取40μg总蛋白与上样液混合、变性，将蛋白加入电泳孔，电泳分离蛋白质，电泳浓缩胶75V，分离胶120V，转膜。分别加入一抗（1∶1000），4℃孵育过夜，二抗（1∶3000），暗室 X－胶片曝光，显影、定影；凝胶成像系统照相并分析实验结果，蛋白表达量用光密度表示。QuantityOne图像分析软件软件分析目标带的光密度值，计算条带的相对表达量。

2 结 果

2.1 肾复康Ⅱ号对UUO大鼠肾组织形态学的影响 假手术组大鼠各时间点肾脏小管间质结构正常，无炎性细胞浸润。UUO术后7d肾小管上皮细胞弥漫性空泡变性，灶状肾小管扩张，萎缩，偶见坏死。肾间质水肿，较多淋巴细胞、巨噬细胞浸润，肾间质增宽，少许间质纤维化，肾小球病理改变不明显。术后14d，肾小管结构严重破坏，肾小管重度扩张，上皮细胞坏死，肾间质弥漫性巨噬细胞、淋巴细胞浸润和成纤维细胞增生，间质弥漫绿染。术后21d，肾小管和间质的结构进一步破坏，出现弥漫的细胞增殖；治疗组各期可见肾小管坏死及肾间质纤维化，程度较UUO组轻。

对上述Masson染色病理切片采集图像并进行半定量分析，结果见表1和图1。

表1 造模不同时间段各组大鼠肾间质纤维化面积（）（n＝6）

表1 造模不同时间段各组大鼠肾间质纤维化面积（）（n＝6）

注：与模型组比较△P＜0.05

造模后组别7d 14d 21d假手术组 201.75±15.20△ 203.50±33.0△ 201.58±22.75△模型组 675.25±45.2810.20±96.75878.45±75.50小剂量组 475.28±56.20△ 515.40±89.75△ 550.15±75.58△中剂量组 358.96±33.60△ 400.25±57.88△ 437.45±69.81△大剂量组 348.23±43.62△ 389.25±47.63△ 407.75±80.75△

2.2 肾复康Ⅱ号含药血清对TGF-β1所诱导的人肾小管上皮HK-2细胞a-SMA表达的影响 以GAPDH作为内参，免疫印迹法检测肾复康Ⅱ号含药血清对TGF－β1所诱导的人肾小管上皮HK-2细胞a-SMA表达的影响，结果显示肾复康Ⅱ号含药血清和百令含药血清组的a-SMA的表达量明显降低，与TGF-β1组比较，差异有统计学意义（P＜0.01），结果见表2，图2。

表2 含药血清对TGF-β1所诱导的人肾小管上皮HK-2细胞a-SMA表达的影响（n＝3）

3 讨 论 UUO是应用最广泛的肾间质纤维化的动物模型，该模型肾间质纤维化发生迅速[4]，我们选择UUO模型作为软坚散结法研究肾间质纤维化的模型。TGF-β1被公认为是最重要的诱导上皮细胞转分化的核心因子，启动并调节EMT的全过程[5]，TGF-β1作用于肾小管上皮细胞，使其发生转分化为 MyoFb，参与间质纤维化的进程。Smad蛋白是TGF-β家族的下游信号蛋白，TGF-β与其细胞膜表面受体结合后促使Smad蛋白磷酸化，磷酸化的Smad蛋白结合形成寡聚复合物进入核内，通过直接与DNA结合或与其它DNA结合蛋白结合等方式参与启动或抑制 转录因子而发挥作用，调控细胞的增殖、分化、凋亡、TEMT的发生和ECM的堆积。

图1 Masson染色病理切片

图2 TGF－β1所诱导的人肾小管上皮HK-2细胞a-SMA的表达

近年来中医药在治疗肾间质纤维化方面己显示出较为明显的优势，中药多成分，多环节、多层次、多靶点的药理学作用可能是其优势的重要特点之一。本实验大鼠肾间质炎性细胞浸润，肾小管上皮细胞变形，脱落，细胞外基质增加，纤维组织增生，肾间质广泛纤维化，体现了中医痰、瘀固定不移、胶结难去的特点，结合大鼠的全身表现，模型符合中医肾阳亏虚，浊瘀兼有痰阻的证型特点。因此依据其基础病机“肾气亏虚，浊瘀内阻”，制定益肾散结治疗大法，组方肾复康Ⅱ号。其中以山萸肉、菟丝子、金樱子、仙灵脾，温补肾阳，涩精固脱；以丹参、姜黄、赤芍活血化瘀，加用王不留行、鳖甲软坚散结，标本兼顾，扶助正气，祛除淤血积滞。现代药理研究证实，丹参能降低TGF－β1表达，减少α-SMA表达，抑制成纤维细胞增殖、活化，促进其凋亡，以及抑制ECM合成、促进其降解[6]。我们以软坚散结法制定的肾复康Ⅱ号，在防治肾间质纤维化发生，延缓肾脏病发展进程取得较好的临床疗效。

本实验研究显示，肾复康Ⅱ号可以减轻UUO大鼠肾间质纤维化及肾小管的损伤；肾复康Ⅱ号含药血清明显降低TGF-β1所诱导的人肾小管上皮HK-2细胞a-SMA的表达。由此推测，软坚散结法下调肾组织a-SMA的表达，抑制肾小管上皮细胞转分化，抑制细胞外基质的合成，可能是其抑制纤维化的途径之一。

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