呼出气冷凝液检测炎性指标监测在慢性阻塞性肺疾病患者中的临床应用

张旭东

(慈溪市第三人民医院呼吸内科,浙江 慈溪 315324 )

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种慢性呼吸道炎症疾病，表现为不完全可逆的气流受限、慢性缺氧和肺功能减退。目前COPD发病机制尚未明确，主要认为其与免疫细胞引起的炎症反应及蛋白酶失衡，氧化应激反应有关。COPD患者呼吸道内细胞毒性淋巴细胞、中性粒细胞和肺泡巨噬细胞等炎症性细胞数量增加，易于发生气道高反应。近年来研究发现采用呼出气冷凝液(EBC)检测得到的生化标志物可以反映机体的氧化应激或炎症状态〔1,2〕。EBC检测是一种完全无创的检测方法，但因其检测方法、标志物种类选择及标志物的参考值范围都没有标准化，因而该方法还在探索研究。本文旨在探寻EBC中生化标志物在临床上应用于反映COPD患者呼吸功能、呼吸道炎症状态与程度的意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2012年6月至2013年9月在本院呼吸内科就诊的老年COPD患者86例，43例体检人群，分为COPD急性期组、COPD缓解期组及对照组。所有患者和体检人群都具有吸烟史(表1)。诊断标准为2007年中华医学会呼吸病学分会《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》〔3〕。其中包括43例急性加重患者，诊断标准为患者近期有咳嗽、咳痰等急性起病和症状加重的临床表现，如呼吸困难、咳嗽和多痰超出正常的日间变异。排除X线胸片确诊肺炎者及近2 w使用抗生素者或呼吸系统以外部位存在细菌感染者；43例缓解期患者，诊断标准为已经3个月未出现咳嗽、咳痰、喘息及呼吸困难症状者。另选择同期体检人群43例为正常对照组，入组前1个月无呼吸道感染史，肺功能检查显示无气流阻塞。三组均排除有其他肺部疾患者；合并其他部位感染者；免疫系统疾病或于近期使用免疫抑制剂者；有严重心、肝、肾、内分泌、神经系统疾病、恶性肿瘤及血液系统疾病者。研究对象均签署知情同意书，研究设计及实施经过本院伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1肺功能测定 采用德国Jaeger公司肺功能仪测定第1秒用力呼气容积(FEV1)、用力肺活量(FCV)、FEV1%、FEV1/FVC。重复3次，两次间最佳误差<5%，取最大值。

1.2.2EBC检测及收集 采用美国Respiratory Research公司的EBC收集装置Rtube。受检者于收集前静坐休息15 min，用蒸馏水漱口3次，收集时取坐位，带鼻夹，含住口器，保持口唇密闭，经口平静呼吸15 min。如有唾液则嘱患者吞咽，如有咳嗽或嗳气则嘱其脱开接口，待情况缓解后再继续收集。收集量约为1～4 ml，每管约300 μl分装于EP管中，冻存于-80℃冰箱待测。用酶联免疫分析法(ELISA)检测EBC中的白细胞介素(IL)-4、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子(TNF)-α、8异前列腺素(8-iso-PG)及白三稀B4(LTB4)水平。按照美国Jackson公司试剂盒说明书进行操作，计算相应标本的各生化指标含量。

表1 一般情况与肺功能检测结果

2 结 果

2.1EBC检测结果 COPD急性期患者EBC中IL-6、IL-8、8-iso-PG及LTB4均高于缓解期和正常对照组(P<0.05)，而IL-4、TNF-α则未发现有差别；COPD缓解期患者IL-6、8-iso-PG及LTB4高于正常对照组(P<0.05)，而IL-4、IL-8、TNF-α则未发现有差别。见表2。

2.2EBC中各指标相关性分析 EBC中IL-4、IL-6、IL-8、TNF-α、 8-iso-PG及LTB4与各临床指标相关性进行分析，结果发现，EBC检测物中只有IL-8与FEV1/FVC呈负相关，LTB4与FEV1呈负相关，其余未发现相关性。见表3。

表2 呼出气冷凝液检测IL-4、IL-6、IL-8、TNF-α、 8-iso-PG及LTB4比较结果

表3 EBC检测标志物与临床指标的相关性(r值)

3 讨 论

COPD发病机制复杂，其中涉及多种细胞组分参与炎症反应过程。中性粒细胞、TNF-α、IL家族、LTB4等都是重要的炎性细胞，它们的聚集活化都是COPD炎症过程的关键环节〔4〕。此外，肺组织的氧化应激易造成呼吸道损伤，也容易使炎性细胞滞留于肺组织，同时还具有活化调节释放炎性因子，加重各类炎性细胞的聚集。炎症反应和氧化损伤还能使蛋白酶/抗蛋白酶失衡〔5〕。因此，对COPD患者发病过程的各类炎性细胞表达监测有利于判断患者病情、观察疗效进而指导临床用药。

既往的手段主要是依据临床表现，患者症状体征、血气分析、肺功能检查等，但是这些均无法直接体现肺部炎症活动的状态和程度；而检测手段则主要是痰诱导、支气管肺泡灌洗液等，这类容易受到污染或者是侵入性的有创检查，不仅不易反复进行，而且也受到患者发病程度等的身体状况制约〔6〕。EBC检测是近年来逐渐兴起的检查手段，气道内衬液体中的生化分子，平静呼吸时可随气体呼出，遇冷则随水蒸气凝结成为EBC的主要组成部分。EBC包含三大组成成分：水、过氧化氢及其他挥发性有机物；不易挥发也不易溶于水的细胞因子、前列腺素、LTB4等；无法挥发但易溶于水的蛋白类物质。EBC的检测因为不参与疾病的病理生理过程，且操作简单安全，适用于各年龄层和各种患病程度的患者。此外，EBC还能连续反复收集，成为一种实时反映呼吸道炎症情况的理想检测方法。

本研究结果证实COPD急性期和缓解期患者均存在氧化应激和炎症损伤反应，且表现出炎症反应在疾病过程中显示的不同程度。EBC中不挥发物质主要是花生四烯酸的代谢产物。 8-iso-PG 是细胞膜受到活性氧损伤后,脂质花生四烯酸发生过氧化的代谢物，具有稳定性良好的特点。LTB4则是花生四烯酸经过5-脂氧酶(5-LO)代谢途径形成的产物，在刺激下，各类细胞像单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞等都能产生LTB4〔7〕。EBC中的IL家族成员，如IL-4、IL-6、IL-8则是中性粒细胞的趋化因子，即在炎症反应发生时，可从血液中募集大量中性粒细胞，而炎症反应过程中，活化的细胞又会不断分泌，进而加重炎症反应〔8〕。而TNF-α可以诱导炎症反应发生，促进中性粒细胞黏附于呼吸道，也对呼吸道炎症发展起着重要的作用，有研究认为它主要在吸烟的COPD患者与正常对照的吸烟者中显现出差别〔9,10〕。

同样的生化标志物在EBC中与在传统检测标本中,如诱导痰中的浓度并不相同,有些标志物在EBC中的浓度要低些,可能与二者来源不同有关,EBC来自于气道内衬液形成的气溶胶颗粒,而诱导痰则是气道杯状细胞核黏液腺细胞受刺激分泌产生,研究发现COPD缓解期和急性期二者所表现出来有不同的标志物,以及与其他研究不同的结果之处,可以发现,EBC检测方法更适用于急性期COPD〔11〕。

综上，在EBC检测中，虽然目前尚未制定出正常参考值范围、还未建立灵敏度较高的EBC检测方法及EBC所采集到的生物标志物来源还不能准确定位，但是并不影响EBC作为一种完全无创、安全、简便的检测技术的推广和应用，其中像IL-6、IL-8、8-iso-PG及LTB4这些炎性指标在监测呼吸道炎症动态方面已经逐渐显示出应用价值。

4 参考文献

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2马 静,徐永健,刘先胜.呼出气冷凝液检测在呼吸系统疾病中的应用〔J〕.国际呼吸杂志,2010;30(1):54-5.

3中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组.慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2007年修订版)〔J〕.中华结核和呼吸杂志,2007;30(1):8-10.

4张永红，谢新明，李满祥.慢性阻塞性肺疾病生物学标志物的研究进展〔J〕.中华肺部疾病杂志(电子版)，2013;6(3):78-82.

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10Carpagnano GE, Resta O, Gelardi M.Exhaled inflammatory markers in aspirin induced asthma syndrome〔J〕 . Am J Rhinol, 2007;21(5): 542-7.

11Rembert-Koczulla A,Noeske S,Herr C,etal. Acute and chronic effects of smoking on inflammation markers in exhaled breath condensate in current smokers〔J〕. Respiration,2010;79(1):61-7.