2型糖尿病发病过程中microRNA27b、130的表达水平及调节

杨崇哲 刘 丰 银孟卓 潘朝庆 张韶冈

(广州市第一人民医院老年病科，广东 广州 510180)

microRNAs参与细胞凋亡、增殖及分化、个体分化、脂肪代谢、激素分泌等细胞周期及生理过程，其独特的生理功能使其与各种疾病关系的研究成为研究热点〔1～4〕。随着人们生活水平的不断提高，我国糖尿病(DM)尤其是2型糖尿病(T2DM)的发病率呈显著升高趋势。但DM的发病机制尚未完全阐明，在预防和治疗方面也仍不完善〔5，6〕。T2DM是一种多病因的代谢性疾病，与基因异常等多种因素相关。而目前对其大量研究工作仅集中于T2DM编码蛋白的易感基因筛查和功能的鉴定，关于microRNA异常与其发病的关系知之甚少。过氧化物酶体增殖物激活受体gamma(PPARγ)作为治疗DM重要药物的靶点，是在DM分子机制中起重要作用的核受体和转录因子。本实验首次应用实验DM大鼠进行microRNA、PPARγ及其于DM相关性检测，以探讨microRNA在T2DM发病机制中的作用。

1 材料与方法

1.1试剂及设备 链脲佐菌素(STZ，美国sigma公司)；one touchⅡ血糖仪(美国强生公司)；DNA DNase I(fermentas公司)；Taqman microRNA试剂盒 (ABI公司)；LightShiftTM Chemiluminescent EMSA试剂盒(Pierce，美国)；核蛋白提取试剂盒(Pierce，美国)

1.2方法

1.2.1实验动物 动物分组与模型制备：雄性Wistar大鼠30只，体重220～260 g，购于中山大学中山医学院实验动物中心。随机分为对照组，DM 1 w组，DM 1个月组，每组大鼠10只。拟为DM模型组大鼠空腹12 h后按50 mg/kg腹腔一次性注射新配制STZ，72 h后大鼠尾静脉采血测血糖，空腹血糖(FPG)≥16.7 mmol/L者作为大鼠DM模型建立标准。对照组大鼠腹腔注射等剂量的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液。实验期间，所有大鼠分笼饲养，置于温度(20±2)℃，湿度 55%～65%，每天12 h日光照维持，均常规饲料喂养、自由饮水。分别于造模后相应时间以盐酸氯胺酮(2%，1 ml/100 g)麻醉后处死大鼠并分离大鼠股四头肌，组织立即置于-80℃低温冰箱保存。

1.2.2全RNA提取 准备：提取过程中所用的EP管、枪头、容器等均用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)水浸泡12 h后高压消毒。提取时需要佩戴口罩、帽子、手套，谨防RNA酶污染。取组织约100 mg，加入RNA提取液(TRIzol)1 ml研磨组织使其裂解，溶解于TRIZOL中，收集悬液于1.5 ml EP管中，加入200 ml氯仿，上下颠倒摇匀30 s，室温静置10 min。4℃，12 000 r/min离心15 min，可见液体分为三层，将上层移入另一EP管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒摇匀30 s，室温静置10 min。4℃，12 000 r/min离心10 min，弃去上清，加入75%酒精漂洗。4℃，7 500 r/min离心5 min，弃上清，将液体吸干，沉淀干燥，20 μl DEPC处理过的水溶解RNA。DNase I处理除去基因组 RNA含量及纯度测定采用分光光度测定法：OD260/OD280约为2.0，OD260/OD230约为1.4。

1.2.3逆转录及实时定量PCR 以Taqman microRNA试剂盒及TAKARA 将所提取RNA逆转录至cDNA后进行 qPCR 反应。温度设置为：起始模板变性95℃10 min；95℃变性15 s，60℃退火/延伸1 min，共40个循环。每例样本均经三孔重复。microRNA27b，130(miR27b，130)以microRNA RNU6作为内部参照，PPARγ以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内部参照。计算机分析获得样本及内参的Ct值。mRNA相对值=2-ΔΔCT。

1.2.4核蛋白提取及电泳迁移率实验(EM-SA) 取组织约100 mg，使用核蛋白提取试剂盒提取核蛋白，实验步骤按试剂盒说明书进行。以二喹啉甲酸(BCA)法检测上清液中核蛋白浓度，核蛋白于-80℃保存待用。

使用LightShiftTM Chemiluminescent EMSA试剂盒进行凝胶迁移实验，检测PPAR结合能力检测。抽提核蛋白步骤，TRBP探针由上海生物工程生物制品有限公司合成、纯化，序列为5′-CGAACGTGACCTTTGTCCTGGTCC-3′，并在5 端标记生物素。实验步骤按试剂盒说明书进行。

2 结 果

2.1大鼠体重、血糖的变化 DM各组大鼠的FPG均在≥16.7 mmol/L。与对照组相比，1 w时DM组大鼠血糖显著增高，1个月时DM组大鼠体重、血糖差异均有统计学意义(均P<0.01)，见表1。

表1 各组大鼠体重、血糖的变化

2.2miR27b、miR130、PPARγ在大鼠骨骼肌的表达 与对照组相比，DM组大鼠骨骼肌中miR20b的RNA水平表达明显增加(P<0.01)，miR130的RNA水平表达显著降低(P<0.01)；同时PPARγ的mRNA显著降低(P<0.01)，且随着时间延长增加趋势越明显。见图1。

与对照组比较：1)P<0.05

2.3大鼠骨骼肌中PPAR结合能力改变 EM-SA电泳条带灰度分析,与对照组相比，糖尿病组大鼠骨骼肌中PPAR的DNA结合能力也显著降低(P<0.01)，且随着时间延长增加趋势越明显。见图2。

图2 各组大鼠骨骼肌中PPAR结合能力

2.4DM组大鼠血糖与miR27b及miR130相关性研究 以于对照组相比，miR27b、miR130在大鼠骨骼肌的相对RNA表达水平同大鼠血糖水平进行相关性分析。DM组大鼠血糖水平与miR27b的RNA水平存在负相关(R=-0.918，P<0.01)，与miR130存在正相关(R=0.833，P<0.01)。见图3，图4。

图3 DM组大鼠血糖与miR27b相关性研究

图4 DM组大鼠血糖与miR130相关性研究

3 讨 论

PPARγ属于核受体超家族，是包括PPARα和PPARβ/δ在内的NR1C亚类中的成员之一〔7〕。NR1C亚类中的这些受体与维甲酸类X受体(RXR)形成异二聚体，结合于特异的DNA序列而使靶基因激活从而调节目的基因的转录。PPARγ活化后可能影响到其他组织，PPARγ的选择性配体不仅能有效降低如骨骼肌的葡萄糖利用，还可调节由脂肪组织分泌的一些特殊信号分子，如肿瘤坏死性因子(TNF-α)、瘦素(Leptin)等，这些产物反过来又可调节其他组织的糖代谢〔8〕。本研提示在DM大鼠1 w时活性就明显降低，且随着病程的延长、血糖增高加重而持续，也证实了PPARγ 参与了血糖调节紊乱的发生和发展。

研究表明一个microRNA家族可能结合至多达200个靶基因，而microRNA可能调控约30%的基因，从而参与多种病理和生理过程。PPARγ受多种microRNA调节，miR27b、miR130可通过影响PPARγ基因转录调控脂肪细胞生成分化〔9〕。本研究提示miR27b、miR130可能通过调节PPARγ参与DM过程中血糖调节作用。

T2DM过程中，microRNA表达增加，伴随明显PPARγ抑制能明显促进其他靶基因的转录。本研究揭示了microRNA参与PPARγ转录激活调节的新机制。与此一致的是，由于RXR同样在PPARγ的转录激活过程中发挥了重要作用，microRNA对RXR与PPARγ相互作用的影响机制有待进一步研究。

综上，microRNA 可通过调节PPARγ参与DM的发生、发展，并且随着对microRNA调控基因表达的研究逐步深入，这种调控机制将在DM预防及治疗中发挥重要作用，也帮助我们理解高等真核生物的基因组繁杂的功能及复杂的基因表达调控网络。

4 参考文献

1Winter J，Jung S，Keller S，etal.Many roads to maturity：microRNA biogenesis pathways and their regulation〔J〕.Nat Cell Biol，2009；11(3)：228-34.

2Selbach M，Schwanhausser B，Thierfelder N，etal.Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs〔J〕.Nature，2008；455(7209)：58-63.

3Lu J，Getz G，Miska EA，etal.MicroRNA expression profiles classify human cancers〔J〕.Nature，2005；435(7043)：834-8.

4Williams AH，Liu N，van Rooij E，etal.MicroRNA control of muscle development and disease〔J〕.Curr Opin Cell Biol，2009；21(3)：461-9.

5司 涟，宗 允.社区糖尿病流行病学的调查及启示〔J〕.中国医药导报，2009；6(14)：129-30.

6秦家碧，杨土保，黄碧云，等.我国糖尿病合并高血压治疗临床试验文献的循证医学分析〔J〕.中国老年学杂志，2012；32(1)：35-8.

7姚芳芳，郭长存，丁 杰，等.RUNX3、SLC22A4和PPAR-γ的基因多态性与溃疡性结肠炎的关系〔J〕.现代生物医学进展，2010；10(7)：1217-9.

8Lee EK，Lee MJ，Abdelmohsen K，etal.miR-130 suppresses adipogenesis by inhibiting peroxisome proliferator-activated receptor gamma expression〔J〕.Mol Cell Biol，2011；31(4)：626-38.

9Kravchenko NA，Iarmysh NV.The role of PPARs and their isoforms in metabolic disorders related to insulin resistance and diabetes〔J〕.Tsitol Genet，2011；45(3)：68-78.