御糖丸对糖尿病大鼠心肌酶及过氧化物酶体增殖剂活化受体α mRNA表达的影响

刘 丰，杨云松，谢 宁

（黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040）

御糖丸对糖尿病大鼠心肌酶及过氧化物酶体增殖剂活化受体α mRNA表达的影响

刘 丰，杨云松，谢 宁

（黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040）

目的 研究中药御糖丸对糖尿病大鼠心肌能量代谢酶、过氧化物酶体增殖剂活化受体α（PPARα）mRNA表达的影响，探讨该药物防治糖尿病心肌病发生的疗效及可能机制。方法 采用SD大鼠腹腔注射STZ方法建立实验动物模型，成模后将大鼠模型分为模型组、御糖丸高、中、低剂量组，造模后8周分别按实验要求灌胃治疗，正常对照组灌生理盐水，连续4周。高效液相色谱法测定大鼠心肌组织肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）和琥珀酸脱氢酶（SDH）活性，逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）测定心肌组织PPAR mRNA表达。结果

空白模型组大鼠心肌CK、LDH、SDH活性普遍降低，指标明显低于正常对照组（P＜0.01），御糖丸各剂量组指标较空白模型组均有提升，但中剂量组和高剂量组提高显著（P＜0.05）。空白模型组PPAR mRNA表达水平显著低于正常对照组（P＜0.01），御糖丸各剂量组PPARa mRNA表达水平均高于空白模型组（P＜0.05），但中高剂量组提高较为显著（P＜0.01）。结论 中成药御糖丸能够提升糖尿病大鼠心肌酶CK，LDH，SDH的活性和上调PPARa mRNA表达水平，对改善心肌能量代谢和保护心肌组织具有良好作用。

糖尿病心肌病;御糖丸;能量代谢;大鼠

随着人们生活水平的提高，人口老龄化以及肥胖的问题越来越突出，糖尿病发病率呈逐年上升的趋势。糖尿病是目前最常见的慢性病之一。糖尿病性心肌病是糖尿病的一种重要的并发症。心肌物质和能量代谢改变，是糖尿病心肌病发生的重要环节［1］，目前对其具体机制尚不完全清楚。近些年，中医和中西医结合治疗该病的研究比较深入，取得了很多有价值的成果［2-3］。2004 年 VanBilsen等［4］提出心肌能量代谢重构的概念，认为心肌细胞糖类和脂肪等物质代谢紊乱引起心脏能量代谢途径改变，从而导致心脏结构和功能异常。我院采用益气养阴法治疗糖尿病心肌病，创制了中成药御糖丸，临床疗效肯定。为了进一步探究其疗效事实背后的科学机制，课题组借助实验研究了糖尿病大鼠心肌细胞能量代谢的变化以及御糖丸对其产生的影响，从而探讨中药防治糖尿病心肌病发生的可能机制。报告如下。

1 材料

1.1 试剂 测定心肌组织肌酸激酶（CK）试剂盒，乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒，琥珀酸脱氢酶（SDH）试剂盒，均由南京建成生物工程研究所提供;测定心肌组织过氧化物酶体增殖剂活化受体（PPAR）mRNA表达的RT-PCR试剂盒（杭州博日科技有限公司提供），Trizol试剂（上海生工提供），DNA Marker（北京艾德莱生物科技有限公司提供）;6xRNAloadingbuffer上样液（上海生工提供）。

1.2 仪器 3k15高速冷冻离心机（德国Sigma公司），T148050-900型 PCR仪（德国 Biometra公司），水平电泳仪（美国伯乐BIO-RAD公司），Dolphin Doc凝胶成像系统和Dolphin-ID软件（美国Wealtec公司），21型分光光度计（上海第二分析分析仪器厂），高压灭菌锅（日本三洋公司），MP200A型电子天平（上海良平仪器厂），MDF-382E型超低温冰箱（日本三洋公司），电热恒温水浴锅（上海医疗器械五厂）。

1.3 动物 60只8周龄SD大鼠，雌雄各半，体质量150～210 g，由长春中医药大学实验动物中心提供。

1.4 制剂 御糖丸（由黑龙江省中西医结合研究所制剂室生产）药物组成:西洋参、黄芪、山药、玉竹、龟板、白芍、麦冬、山茱萸、女贞子、乌梅、鹿茸、葛根等组成。水煎3次，每次煎煮30 min，将滤液蒸发为分别含生药1.0，1.8，2.0 g/mL的低、中、高剂量汤剂。

2 方法

2.1 造模方法 将SD大鼠雌雄随机各抽取5只，作为正常对照组，其余50只作为造模用，禁食（不禁水）2 h后，每只大鼠腹腔注射用0.1 mmol/L柠檬酸缓冲液（pH为4.2）配制的0.55%STZ（55 mg/kg）完成造模［5］。1周后采用眼外眦取血，测空腹血糖，血糖高于13.8 mmol/L（250 mg/dL）为造模成功［6］。正常对照组腹腔内相应注射等体积枸橼酸缓冲液，各组大鼠均喂以普通饲料（正常饮水）。

2.2 分组与处理 选取DM造模成功大鼠40只，随机平均分入模型组、御糖丸高、中、低剂量组，各组大鼠分别给予灌胃治疗，模型组用生理盐水6.5 g/kg灌胃，低、中、高剂量组各按7，12.6，14 g/kg 灌胃，1 次/d，连续给药4周。正常对照组10只大鼠不做任何处理。

2.3 指标检测 样本采集:冰上迅速解剖取其心室肌组织，4℃生理盐水清洗，剪成小块装入冻存管中，先置液氮中，后转入－80℃冰箱中待测。

2.4 心肌酶活性测定 术后腹腔麻醉处死，迅速摘取心脏，用冷生理盐水冲洗，切取左心室肌组织约100 mg，编号用冰生理盐水制备成10%的匀浆，迅速离心，取上清液用相应心肌酶测定试剂盒测定CK和LDH 活性［7-8］。

2.5 心肌组织PPAR mRNA表达测定 依据Gene Bank中大鼠的PPAR mRNA序列及β-ActinmRNA序列设计引物，经blast进行特异性确定，最后由上海生工生物工程技术服务有限公司合成引物。对心肌组织总RNA用Trizol试剂进行提取，提取后取5 μL RNA加入95 μL DEPC水中，经紫外分光光度计A260/A280，比值大于或等于 1.80，以 A260计算RNA的浓度;同时取10 μL RNA进行Agarose凝胶电泳实验，观察28，18，5 s的完整性，结果说明RNA样品纯度理想，其余置－80℃冰箱中保存备用。接着进行RT逆转录反应、PCR扩增反应，对RT-PCR产物进行鉴定及定量分析。

2.6统计学方法所有数据以均数±标准差（±s）表示，各组间比较采用t检验，采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。

3 结果

3.1 对糖尿病大鼠心肌CK，LDH，SDH活性的影响见表1。

表1 对糖尿病大鼠心肌CK，LDH，SDH活性的影响（±s，n=10）U/mgprot

表1 对糖尿病大鼠心肌CK，LDH，SDH活性的影响（±s，n=10）U/mgprot

注:与正常对照组比较，##P＜0.01;与空白模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组 别 剂量/（g·kg）CK LDH SDH正常对照组 — 161.01±11.06 6 352.22±441.07 7.36±1.12空白模型组 — 87.23±15.28## 3 685.26±312.32## 2.34±1.07##御糖丸低剂量组 7 97.13±17.12△△ 4 156.41±428.27△ 2.56±1.16△御糖丸中剂量组 12.6 113.41±16.33△△ 5 077.34±399.21△ 5.94±1.09△御糖丸高剂量组 14 136.22±11.25△△ 5 286.63±441.35△ 6.12±1.17△

3.2 对糖尿病大鼠心肌PPARa mRNA相对表达量的影响 见表2。

表2 对糖尿病大鼠心肌PPARa mRNA相对表达量的影响（±s，n=10）

表2 对糖尿病大鼠心肌PPARa mRNA相对表达量的影响（±s，n=10）

注:与正常对照组比较，##P＜0.01;与空白模型组比较，△△P＜0.01

组 别 剂量/（g·kg） PPARa mRNA/β-action正常对照组 — 1.95±0.11空白模型组 — 1.15±0.10##御糖丸低剂量组 7 1.28±0.06△△御糖丸中剂量组 12.6 1.56±0.15△△御糖丸高剂量组 14 1.88±0.12△△

4 讨论

中药御糖丸的配方是根据健脾补肾、益气养阴法的治疗原则，结合现代药理研究成果，精心选择药物组配成的方剂。方中西洋参作为君药，归心脾肾经，能补气养阴、清火生津。黄芪功擅补气升阳，生津止渴。山药为臣，味甘性平，主归脾肺肾经，能益气养阴，补脾肺肾。山茱萸补精又助阳，为平补阴阳之品。玉竹味甘，归肺胃经，长于养阴润燥，生津止渴，补养而不恋邪。麦冬味甘，养阴润肺，益胃生津。葛根为佐使药，性味甘辛而凉，入足太阴脾经和足阳明胃经，能主消渴。乌梅味酸涩性平，入肺脾大肠经，有敛肺，涩肠，生津之功。白芍功效养血敛阴，柔肝止痛，平抑肝阳。女贞子甘苦性凉，归肝肾经，补中兼清，能滋养肝肾之阴。龟板甘咸寒，滋阴潜阳，养血补心。鹿茸甘咸温，入肝肾经，补肾阳，益精血，强筋骨。诸药合用，共奏补肾益气，滋阴生津，活血通络之功。临床及实验研究证实，具有良好的降血糖作用。

从本研究的结果来看，空白模型组大鼠心肌CK、LDH、SDH活性普遍降低，指标显著低于正常对照组（P＜0.01），御糖丸各剂量组指标较空白模型组均有升高，但中剂量组和高剂量组提升显著（P＜0.05）。空白模型组PPARmRNA表达水平显著低于正常对照

组（P＜0.01），御糖丸各剂量组PPARamRNA表达水平均高于空白模型组（P＜0.05），但中高剂量组提高较为显著（P＜0.01）。这一结果说明:1）糖尿病模型大鼠会出现心肌细胞能量代谢障碍;2）不同剂量的中药御糖丸不仅具有降糖作用，还能较好地干预心肌能量代谢，但是，低剂量的作用效果不如中、高剂量;3）基于心肌酶变化的分析，可以认为中药御糖丸能降低糖尿病大鼠模型的心肌损伤，其机制可能是减轻心肌细胞膜损伤，稳定细胞膜，减少了CK，LDH，SDH等酶的漏出，纠正能量代谢障碍，增加心肌收缩和舒张能量的供应和储备，从而改善心肌功能，对防止糖尿病心肌病的发生具有重要意义;4）中药御糖丸干预糖尿病心肌能量代谢的机制尚不明了，但从本研究结果分析，其作用机制可能与心肌PPARa调控有关，需要深入研究。

:

［1］陈灏珠.实用内科学［M］.北京:人民卫生出版社，2005:1015-1062.

［2］李莲静.中医药辨证防治糖尿病心肌病的进展［J］.吉林中医药，2004，24（4）:60-61.

［3］刘苇苇，陈惠，游焌，等.糖尿病心肌病的中西医诊疗［J］.吉林中医药，2012，32（10）:998-1002.

［4］Van Bilsen M，Smeets P J，Gilde A J，et al.Metabolic remodelling of the failing heart:the cardiac burn-out syndrome［J］.Cardiovasc Res，2004，61（2）:218-226.

［5］沈亚非，徐焱成.链脲佐菌素诱导实验性糖尿病大鼠模型建立的研究［J］.实用诊断与治疗杂志，2005，19（2）:79-80.

［6］范世平，饶振芳，马晓霖，等.糖心宁胶囊治疗糖尿病性冠心病的实验研究［J］.新中医，2001，33（7）:75-77.

［7］姜德友，栗明，柳成刚.糖心康对糖尿病大鼠心肌能量代谢的影响［J］.美国中华现代医学杂志，2003，1（6）:15.

［8］潘蓉，李玲.丹参水提物对心肌缺血/再灌注损伤大鼠心率及心肌酶谱的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18（4）:232-234.

Effect of Yutang Pill on myocardial enzymes and PPARa mRNA expression of diabetic rats

LIU Feng，YANG Yunsong，XIE Ning
（Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine，Harbin 150040，China）

ObjectiveTo study the effect of Yutang Pill on myocardial energy metabolism enzyme agent and peroxidase proliferation activated receptorα （PPARα）mRNA expression of diabetic rats，and to discuss the curative effect and possible mechanism of the drug's prevention and treatment for diabetic cardiomyopathy.MethodsResearchers use STZ intraperitoneal injection for SD rats to establish the experimental animal models and then divide the rats into model group，yu-tang pill high dose group，Yutang Pill medium and low dose groups.8 weeks after the modeling，different lavage treatment，as required above，are applied to different groups for four weeks and control group use saline.High performance liquid chromatography is used to test creatine kinase（CK），lactate dehydrogenase（LDH），succinate dehydrogenase（SDH）activity and reverse transcriptase-polymerase chain reaction（RT-PCR）is used to test the expression of PPARα mRNA.ResultsMyocardial CK，LDH，SDH activity in blank model group are generally declined and the index is significantly lower than that of the normal control group（P ＜0.01）.For group with different dose of Yutang Pill，the index is higher than the blank model group，among which the medium and high group improved significantly（P ＜0.05）.PPARαmRNA expression level of blank model group is significantly lower than normal control group（P ＜0.01），and PPARαmRNA expression level of group with different dose of Yutang Pill are high-er than blank model group（P ＜0.05），among which the medium and high group improved significantly（P ＜0.01）.ConclusionYutang Pill can improve diabetic rats'myocardial enzyme CK，LDH and the activity of SDH and raised PPARαmRNA expression level，which is beneficial to improve myocardial energy metabolism and protect myocardial tissue.

diabetic cardiomyopathy;Yutang Pill;energy metabolism;rat

R285.5

A

2095－6258（2014）05－0787－03

10.13463/j.cnki.cczyy.2014.05.010

黑龙江省政府博士后资助基金项目（LBH-Z09005）。

刘 丰（1972－），男，医学博士，博士后在站，副主任医师。研究方向:中西医结合防治心血管病、代谢综合征。

2014－05－07）