通补消积饮对人肺腺癌A549细胞PCNA蛋白表达的影响

李义君，刘建秋，全丽娜

（1.黑龙江中医药大学附属第二医院，哈尔滨 150001;2.黑龙江中医药大学附属第一医院，哈尔滨 150040;3.哈尔滨医科大学附属肿瘤医院，哈尔滨 150040）

通补消积饮对人肺腺癌A549细胞PCNA蛋白表达的影响

李义君1，刘建秋2，全丽娜3

（1.黑龙江中医药大学附属第二医院，哈尔滨 150001;2.黑龙江中医药大学附属第一医院，哈尔滨 150040;3.哈尔滨医科大学附属肿瘤医院，哈尔滨 150040）

目的 研究通补消积饮对A549细胞PCNA蛋白表达的影响，探讨通补消积饮治疗肺癌的作用机制。方法 用Western-blot法检测通补消积饮对A549细胞PCNA蛋白表达的影响。结果 通补消积饮低、中、高剂量组含药血清作用于A549细胞48 h后，PCNA蛋白相对表达量分别为（0.749±0.083），（0.534±0.052），（0.402±0.048），通补消积饮各剂量组与空白血清组比较，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），并表现出明显剂量依赖性。结论 通补消积饮能明显抑制A549细胞PCNA蛋白的表达。

通补消积饮;肿瘤;A549细胞;PCNA蛋白

肺癌常见的病理类型是腺癌，占全部肺癌病人的40%左右［1-3］。目前我国多数肺癌患者确诊时已是中、晚期，失去了手术治疗的机会，以中医药治疗为主结合姑息性放、化疗及靶向治疗的综合性治疗在临床实践中日益显示出其重要性［4］。通补消积饮是针对中晚期非小细胞肺癌的病机特点，在多年临证中总结的经验方。笔者研究了通补消积饮对A549细胞PCNA蛋白表达的影响。总结报道如下。

1 实验材料

1.1 细胞株及实验动物 实验瘤株为人肺腺癌A549细胞，制备含药血清动物为Wistar雄性大鼠。

1.2 主要仪器 二氧化碳孵育箱:NO.NU-5500E，美国NUAIR公司。医用超净工作台:CJ-2F，中国苏州。高速台式离心机:5415R，德国EPPENDORF公司。低速离心机:B40，中国河北安新。电热恒温水槽:DK-8D，上海一恒科技有限公司。电泳仪:DYY－122，北京六一仪表厂。垂直电泳槽及制胶装置:美国BioRad公司。酶标仪:450，美国伯乐。

1.3 主要药品与试剂 通补消积饮中药复方由黑龙江中医药大学附属二院饮片药局提供。顺铂:齐鲁制药有限公司。RIPA裂解液:上海碧云天生物试剂有限公司。Bradford法蛋白定量试剂盒:上海美季生物技术有限公司。辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H+L）:碧云天生物技术研究所。ECL试剂盒:上海碧云天生物试剂有限公司。Beta Actin antibody、PCNA antibody:Abcam香港公司。

1.4 数据统计 数据分析采用SPSS 17.0统计软件处理。组间比较采用t检验，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，P＜0.05为有统计学意义。

2 实验方法

2.1 含药血清制备 取Wistar雄性大鼠20只，随机分为5组。通补消积饮低、中、高剂量组给药剂量分别为28，56，112 g/（kg·d），分 2次灌胃;空白血清组:灌生理盐水，分2次灌胃;顺铂组:正常大鼠血清中加入顺铂制成浓度为2.5 μg/mL含药血清;连续给药5 d，末次给药前禁食12 h，但不禁水。第5天灌服1 d剂量，2 h后将大鼠麻醉，心脏穿刺采血取含药血清，过滤除菌，冰箱保存备用。

2.2 细胞培养 将复苏后的A549细胞接种于培养瓶中培养，待细胞贴壁后，用胰蛋白酶消化，进行传代培养。实验时取对数生长期细胞。

2.3 Western-blot法 检测通补消积饮对A549细胞PCNA蛋白表达的影响。

2.3.1 蛋白的提取 将A549细胞接种于培养瓶中，待细胞贴壁后，分别加入各组血清作用48 h后收集细胞。将收集的各组细胞离心，弃上清，EP管标记好组别。向各组EP管内加入适量细胞裂解液（RIPA裂解液+PMSF）并充分混匀，再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后离心5 min，取上清。

2.3.2 Bradford法进行蛋白定量 取出适量已保存于冰箱的Bradford 2×染色液，将其平衡至室温，酶标仪预热20 min。用适量的蛋白标准品，加入去离子水，将其从原液5 mg/mL稀释至1 mg/mL，振荡混匀后室温放置。用酶标仪测定595 nm处的吸光值，以不含BSA的光吸收值为空白对照。以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线。将待测蛋白样品用去离子水稀释至适当浓度，取10 μL样品，加入100 μL 2×Bradford染色液和90 μL的去离子水，混匀后放置，测定样品吸收值A595。根据测得的吸收值，在标准曲线上即可查得样品的蛋白含量。

2.3.3 Western-blot分析

2.3.3.1 SDS-PAGE电泳 制胶玻璃板垂直装在制胶架上固定器固定，灌入分离胶于玻璃槽中，上面加少量的去离子水，胶凝固后弃上层水，在分离胶上直接灌入浓缩胶，立即插入样品梳子，等待胶凝固。在样品（取50 μg蛋白）中加入2×SDS加样缓冲液，使蛋白质变性、解聚。将凝固后的凝胶放入电泳槽中，加上电泳缓冲液，取出梳子，已处理好的样品上样到凝胶样品孔内。上层胶用80 V电压，当样品至分离胶时，用120 V电压，溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，一般电泳时间在1.5 h左右。

2.3.3.2 转膜 将凝胶、海绵垫、PVDF膜、滤纸等转膜所用的物品浸泡于转膜缓冲液中。在电泳转膜装置的阳极上先放海绵垫，再放3张滤纸，之后放PVDF膜，在PVDF膜上面放凝胶，再放3张滤纸，之后放海绵垫，海绵垫上面是阴极，用玻璃棒排除气泡后封闭电转移，转移方向是从负极转向正极。

2.3.3.3 封闭 将电转移后的PVDF膜水漂洗后放入封闭液中，振摇封闭1 h。

2.3.3.4 孵育抗体 一抗溶液为PCNA抗体和βactin抗体的稀释溶液，二抗溶液为HRP标记山羊抗兔IgG稀释溶液。在一抗溶液中放入PVDF膜，4℃振摇孵育2 h，之后用 TBST液洗膜3次，然后将PVDF膜放入二抗溶液中，常温振摇孵育2 h，之后用TBST液洗膜3次，再换用TBS洗膜2次。

2.3.3.5 显色 将PVDF膜放入双蒸水中5min，之后进行ECL反应，放入暗盒，进行X线压片，进行显影。

2.3.3.6 ImageJ图像分析 应用ImageJ图像分析软件对Western-blot图片进行灰度分析和统计学分析。求得PCNA基因蛋白条带的灰度值/β-actin基因蛋白灰度值的比值作为PCNA蛋白的相对表达量。

3 实验结果

从Western-blot图片以及结果分析可以看出（见表1，图1），通补消积饮含药血清作用于A549细胞48 h后，PCNA蛋白表达显著下降，且随着通补消积饮剂量的增加，PCNA蛋白表达逐渐下调。各组PCNA蛋白相对表达量分别为空白血清组（0.893±0.065），通补消积饮低剂量组（0.749±0.083），通补消积饮中剂量组（0.534±0.052），通补消积饮高剂量组（0.402±0.048），顺铂组（0.391±0.057）。通补消积饮各剂量组与空白血清组比较，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），并表现出明显剂量依赖性。通补消积饮高剂量组与顺铂组比较无统计学意义（P＞0.05），而通补消积饮中、低剂量组与顺铂组比较有显著统计学意义（P＜0.01）。

表1 通补消积饮含药血清对A549细胞PCNA蛋白表达的影响（±s，n=4）

表1 通补消积饮含药血清对A549细胞PCNA蛋白表达的影响（±s，n=4）

注:与空白血清组比较，#P＜0.05，##P＜0.01;与顺铂组比较，△△P＜0.01

组 别 PCNA 蛋白相对表达量空白血清组 0.893±0.065通补消积饮低剂量组 0.749±0.083#△△通补消积饮中剂量组 0.534±0.052##△△通补消积饮高剂量组 0.402±0.048##顺铂组 0.391±0.057##

图1 通补消积饮含药血清作用A549细胞48 h后PCNA蛋白表达结果

4 讨论

中医学立足于整体观治疗肿瘤，具有独特理念和优势［5］。肺癌是全身性疾病的局部表现，是由正气内虚，邪毒外侵或者内生，导致痰、瘀、毒、热等留滞于肺脏，久羁而不去，凝聚而成［6］。中晚期非小细胞肺癌的主要证型是气阴两虚型。临床研究［7-8］显示，从肺癌病例的证型分布上看，气阴两虚或阴虚证型占总数的80%以上。肺癌气阴两虚贯穿始终，与肺脏的生理特征有着密切的相关。

增殖细胞核抗原（PCNA）是一种细胞周期调节蛋白，是细胞DNA合成必不可少的因子，肿瘤细胞具有很强的增殖活性，因此检测PCNA在肿瘤细胞中的表达，可以作为判断肿瘤细胞增殖状态的良好指标［9］。很多学者［10-11］在研究中发现，PCNA 在肺腺癌细胞中有过度表达。

通补消积饮由人参、麦冬、黄芪、北沙参、白术、薏苡仁、半夏、陈皮、贝母、全瓜蒌、蚤休、白花蛇舌草、半枝莲、山慈菇、莪术、大黄、甘草，共17味药物组成。通补消积饮是针对中晚期非小细胞肺癌以气阴两虚为主，兼痰、瘀、热毒互结的病因病机而拟定的经验方。本实验结果表明，通补消积饮能有效降低A549细胞PCNA蛋白的表达。通补消积饮对A549细胞增殖抑制作用的可能机制是:通补消积饮能有效下调A549细胞中PCNA蛋白的表达，使DNA的合成受阻，从而达到对A549细胞的增殖抑制，实现其治疗肺癌的目的。

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［1］孙燕，石远凯.临床肿瘤内科手册［M］.北京:人民卫生出版社，2007:388-391.

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Effect of Tongbu Xiaoji Decoction on the expression of PCNA in human lung adenocarcinoma A549 cell

LI Yijun1，LIU Jianqiu2，QUAN Lina3
（1.The Second Hospital Affiliated to Heilongjiang University of TCM，Harbin 150001，China;2.The First Hospital Affiliated to Heilongjiang University of TCM，Harbin 150040，China;3.Cancer Hospital Affiliated to Harbin Medical University，Harbin 150040，China）

Objectives To investigate the influence of the Tongbu Xiaoji Decoction on the human lung adenocarcinoma A549 cells and the expression of PCN，thus to discuss the mechanism of the Tongbu Xiaoji Decoction to lung carcinoma.MethodsThe expression of PCNA protein in A549 cells were evaluated by Western blot.Result Tongbu Xiaoji Decoction with low、median and high dose medicated serum were used to affected A549 cell in 48 h separately.The protein expression of PCNA of A549 cells was significantly decreased and the values were（0.749 ±0.083），（0.534±0.052）and（0.402 ±0.048）.Compared with that of blank group，Tongbu Xiaoji Decoction with low、median and high dose medicated serum had a significant difference（P ＜0.05/P ＜0.01），and the affection shows a dose-dependent manner.Conclusions Tongbu Xiaoji Decoction inhibited the protein expression of PCNA to A549 cells significantly.

Tongbu Xiaoji Decoction;Cancer;A549 Cell;PCNA

R285.5

A

2095－6258（2014）05－0790－03

10.13463/j.cnki.cczyy.2014.05.011

黑龙江省教育厅科学技术研究项目“通补消积饮对人肺腺癌A549细胞增殖与凋亡影响的研究”（12521509）。

李义君（1979－），男，医学博士，主治医师。研究方向:中医药治疗恶性肿瘤的临床与实验研究。

2014－05－20）