内质网应激与氧化应激在百草枯致大鼠肺纤维化中的作用及沙苑子总黄酮的影响

张志坚 周从阳 彭礼波 吴灿 田黎 首云峰

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2014.09.012

基金项目：重庆市卫生局科研项目（2012-2-419）

作者单位：401320 重庆，巴南区人民医院ICU（张志坚、彭礼波），骨科（吴灿），感染科（田黎），心内科（首云峰）；南昌大学第一附属医院急诊科（周从阳）

通信作者：彭礼波，Email：plbbnicu@yeah.net

肺纤维化（pulmonary fibrosis）是由多种致病因素导致肺损伤后出现的一种严重并发症，目前对其发病机制尚未完全明确，常常因弥漫性肺泡炎症、肺成纤维细胞增殖及细胞外基质过度沉積引起严重的临床症状^[1-3]。百草枯（paraquat，PQ） 作为农业生产中常用的除草剂，自问世以来中毒事件屡有发生，甚至有越来越多的趋势。肺脏是PQ作用于机体的最主要的靶器官，肺纤维化是其后期的最常见的致死原因。虽然国内外对PQ中毒进行了积极的研究，但至今尚未发现确切改善其预后的药物及治疗方法，因此，寻找有效的减轻肺纤维化的药物，成为广大研究者共同关注的焦点。

沙苑子总黄酮（total flavonoids from astragalus complanatus，FAC）是从中药沙苑子成熟种子中提取的有效成分。沙苑子具有补益肝肾的功效，其主要成分为黄酮类、三萜类及有机酸，目前已发现FAC具有抗纤维化、抗衰老、抗肿瘤等作用^[4-5]。但FAC对PQ诱导的肺纤维化治疗作用鲜有报道。本文采用PQ灌胃法制作大鼠肺纤维化模型，初步探讨FAC对肺纤维化的干预作用及相关机制。

1 材料与方法

1.1 主要实验药物及试剂

20%百草枯溶液由上海先正达公司提供；沙苑子总黄酮由苏州中药研究所植化室提供； 羟脯氨酸（HYP）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）考马斯亮蓝试剂盒购于南京建成生物工程研究所。兔抗大鼠多克隆GRP78抗体、免疫组化SABC试剂盒及DAB显色剂均购于武汉博士德公司。

1.2 实验动物分组及模型制作

30只清洁级Spragne-Dawley（SD）大鼠，体质量（220±40）g，由南昌大学动物科学部提供。将实验动物随机（随机数字法）分为正常对照组（正常组），肺纤维化模型组（模型组）和沙苑子总黄酮治疗组（FAC组）。模型组和FAC组参照文献[6]PQ灌胃法诱导肺纤维化模型。正常组给予等量生理盐水灌胃。从造模第2天开始，FAC组即给予FAC 70 mg/（kg·d）灌胃治疗，而模型组和正常组给予等量生理盐水灌胃。于造模后第28天股动脉放血处死所有大鼠。

1.3 组织标本采集及检测指标实验方法

1.3.1 肺组织采集 按预定时间点称重后处死动物。分离主支气管并向下剥离后取出全肺，无菌生理盐水冲洗，滤纸吸干并称质量，计算肺系数（肺系数=肺湿质量/体质量）。取右肺中叶4%中性甲醛溶液固定48 h后转移至0.1 mol/L PBS溶液中保存，待行肺组织病理学形态及免疫组化检测。左肺中叶取下后-80 ℃保存，待测HYP、SOD及MDA。

1.3.2 肺组织HYP、MDA含量及SOD活性测定 按试剂盒说明书进行检测。

1.3.3 肺组织GRP78蛋白免疫组织化学检测 切片常规脱蜡水化，3%H2O2处理，微波修复抗原，滴加兔抗大鼠GRP78多克隆抗体（质量分数5%），4 ℃过夜后加生物素化羊抗兔IgG，在37 ℃孵育30 min，加SABC工作液，DAB显色，苏木素染色。阴性对照以PBS缓冲代替一抗。每个样本随机抽取5个高倍镜下观察，以胞浆黄染的细胞作为GRP78阳性表达的细胞，计算出阳性表达细胞占细胞总数的百分比。阳性细胞百分率=（阳性细胞数/细胞总数）×100%。

1.3.4 肺组织病理学观察 取右肺下叶，用4%甲醛溶液固定，按病理学方法脱水、包埋、切片，进行HE和Masson染色，光镜下观察肺泡炎、肺纤维化程度，参照Szapiel等^[7]的方法观察肺泡炎程度并分级计分，采用Hubner等^[8]的方法观察肺纤维化程度并进行评分。

1.4 统计学方法

所有数据采用SPSS 16.0统计软件分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物28 d病死率

3组大鼠28 d内仅模型组死亡1只；对照组及FAC组均无大鼠死亡；病死率比较差异无统计学意义（P>0.05）。

2.2 肺组织形态学改变

正常组肉眼见肺组织呈均匀粉红色，表面较光滑，质软弹性好。模型组肉眼见肺组织表面苍白，质硬，弹性降低，部分可见弥漫性出血灶。FAC组肉眼见肺组织表面凹凸不平，弹性降低，局部可见少量出血点。

光镜下对照组肺泡结构清晰，肺泡壁薄，肺泡间隔正常，肺泡腔内无炎性细胞浸润。模型组光镜下见肺间质和肺泡水肿，可见大量炎性细胞浸润，间质内成纤维细胞大量增生，肺泡腔结构破坏，部分被纤维组织取代呈条索样分布。FAC组肺组织内炎症细胞浸润、肺泡破坏程度较模型组明显减轻（图1）。三组大鼠28 d肺组织肺泡炎变及纤维化程度，见表1。

2.3 三组大鼠肺系数比较

模型组与FAC组肺系数为（11.89±1.18）vs.（6.29±1.83），差异有统计学意义（P<0.05）。与对照组（4.59±0.49）比较，差异有统计学意义（P<0.01）。

2.4 三组大鼠肺组织HYP、SOD及MDA含量比较

模型组大鼠肺组织HYP含量明显高于对照组和FAC组（P<0.01）。FAC组较模型组肺组织HYP含量明显下降（P<0.01）。模型组肺组织SOD较对照组明显降低，而MDA则明显升高（P<0.01）；FAC组肺组织SOD含量较模型组明显升高（P<0.05），但低于对照组；而MDA含量明显低于模型组（P<0.01）。见表2。

2.5 三組大鼠肺组织中GRP78蛋白表达比较

对照组大鼠肺组织仅有少数细胞胞浆黄染；模型组肺组织细胞中可见大量GRP78阳性表达呈棕黄色，主要位于支气管上皮细胞及肺泡上皮细胞胞浆内。对照组、模型组与FAC组GRP78阳性细胞百分率分别为（0.15±0.09）%、（0.84±0.15）%和（0.25±0.06）%；三者比较差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。FAC组阳性表达较模型组明显减少。见图2。

3 讨论

肺纤维化是导致呼吸功能严重受损的纤维化疾病，是临床上呼吸衰竭常见原因之一，主要以成纤维细胞增生及细胞外基质的过度沉积为主要的病理特征。随着PQ的广泛使用，中毒事件日趋增多，因其极高的病死率及临床救治的困难，一直都是研究的热点和难点。肺脏是百草枯中毒的主要靶器官，肺纤维化是PQ中毒后期的主要并发症及死亡原因，寻找有效改善PQ后肺纤维化是当前研究的重点。本研究以PQ灌胃复制肺纤维化动物模型比较接近于临床常见情况。

沙苑子为豆科植物扁茎黄芪（Astragalus complanatus R.Br）干燥成熟的种子。在近年的研究中发现其对肝、肾、免疫系统及循环系统均有一定的药理效应。沙苑子总黄酮为沙苑子的乙醇提取物，其主要有效成分是黄酮，其主要的药理作用为抗脂质过氧化、抗肝纤维化、诱导白血病细胞凋亡、调节机体免疫功能及改善血液流变学^[9-11]。但它对机体内质网应激的影响尚未见报道。

羟脯氨酸（HYP）因其在胶原组织中占13.4%，而在弹性蛋白中含量极少，故检测肺组织HYP含量是反映胶原沉积情况的可靠指标。本研究中笔者检测到模型组大鼠肺组织匀浆中HYP较对照组比较明显增多；结合肺组织病理学观察表明该实验肺纤维化模型复制成功。而FAC干预后大鼠肺组织中HYP含量明显减少，结合病理学观察表明FAC能有效减轻PQ导致的肺纤维化程度。

大量基础研究已经表明氧化应激是肺纤维化的重要发病机制之一，特别在PQ中毒中该机制更加重要，因此减轻PQ中毒后氧化应激、纠正机体氧化-抗氧化失衡可明显减轻肺纤维化程度^[12-15]。SOD是机体内最主要的氧自由基清除酶，测定其活力可反映机体自由基清除能力；MDA则是脂质过氧化产物，测定其含量可反映机体组织细胞氧化损伤的程度，对上述指标的联合检测能评价组织细胞的氧化应激水平。本研究发现，模型组肺组织MDA较对照组明显升高，而SOD则明显降低，给予FAC干预后氧化应激指标则明显改善，说明FAC能较好地提高机体抗氧化的能力，在一定程度上能纠正PQ引起的机体氧化-抗氧化失衡。

内质网（endoplasmic reticulum，ER）是哺乳动物细胞重要的Ca2+贮存器，也是蛋白质合成与翻译后修饰、多肽链正确折叠与装配、参与脂质代谢和类固醇激素的合成的重要场所。研究发现，多种因素可导致内质网稳态破坏。而内质网能通过减少蛋白质翻译、分子伴侣以及相关蛋白表达上调，增加未折叠蛋白质降解等途径使内质网恢复稳态，这些变化统称内质网应激（ER stresss）^[16-17]。葡萄糖调节蛋白质78（glucose regulating protein 78，GRP78）是广泛分布于内质网的分子伴侣，其主要功能是协助蛋白质的折叠、装配及运输。当应激因素导致ERS发生后，GRP78合成显著增加，因此又称其为ERS发生的标志性蛋白^[18]。本研究发现模型组大鼠肺组织中ERS标志性蛋白GRP78表达显著增加，而给予FAC干预后肺组织GRP78表达明显下降。实验结果证明PQ诱导肺纤维化过程中，除了氧化应激的参与外，ERS的参与也是重要的一环。但二者之间有何紧密的联系尚需要进一步研究才能得出结论。

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（收稿日期：2014-02-04）

（本文编辑：邵菊芳）

P998-1000