高效液相色谱法测定斑蝥素钠维生素B6注射液中维生素B6的含量

江苏省泰州市食品药品检验所 （225300） 顾秋琴

斑蝥酸钠维生素B6注射液（Disodium Cantharidinate and Vitamin B6Injection）为复方制剂，其组分为：斑蝥酸钠和维生素B6，适用于原发性肝癌、肺癌及白细胞低下症。维生素B6参与氨基酸和脂肪的代谢，刺激白细胞生成。该制剂中维生素B6的含量测定现行国家药品标准WS-10001-(HD-0046)-2002采用吸收系数法，方法易受影响因素干扰，专属性不高。本文建立了操作简便，专属性更强的HPLC法测定维生素B6的含量，结果准确。

1 仪器与试药

1.1 仪器 美国Waters 2695型高效液相色谱仪（检测器：Waters2996二极管阵列），waters symmetry C18色谱柱（150mm×4.6mm,5μm）；日本岛津UV-2550型紫外分光光度计。

1.2 试药 斑蝥酸钠维生素B6注射液（贵州某制药股份有限公司，规格：10ml，批号：2012090901，2012100403，2013040201）；斑蝥酸钠（厂家提供）；戊烷磺酸钠、冰醋酸均为分析纯，水为超纯水，甲醇为色谱纯。

1.3 对照品 维生素B6对照品（中检院，批号10116-201103，含量：100.0%）。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取对照品维生素B650mg，置50ml容量瓶中，加水适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液；精密量取对照品储备液5ml，置100ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密量取供试品10ml（约相当于维生素B62.5mg），置50ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.3 空白溶液的制备 按处方比例，取斑蝥酸钠适量加注射用水制成空白供试品，再精密量取空白供试品10ml，置50ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

附图 高效液相色谱图

附表 1 回收率试验结果（n＝6）

附表 2 样品含量测定结果（标示量/%）

2.2 色谱条件与专属性考察 以0.04%戊烷磺酸钠（用冰醋酸调节pH值至3.0）-甲醇（88∶12）为流动相，检测波长为291nm；流速约为1.0mL·min-1；柱温为35℃；进样量10μL。分别取对照品溶液、供试品溶液、空白溶液进样，记录色谱图。结果空白溶液无干扰，理论板数按维生素B6计算约为4500，见附图。

2.3 标准曲线与线性范围 分别精密量取维生素B6对照品储备液1ml、2ml、3ml、4 ml、5ml置25ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。照“2.2”项下色谱条件分别进样，结果在39.33～196.6 mg·L-1范围内，回归方程A=23169C+8178（r＝1.000），色谱峰面积与浓度呈良好线性关系。

2.4 精密度与重复性实验 取浓度为49.16mg·L-1的对照品溶液重复进样5次，测得峰面积的RSD为0.25%(n＝5),表明本方法的精密度良好；取供试品（批号：2012090901），平行制备5份供试品溶液，分别测定维生素B6的含量，平均为99.74%， RSD为0.21%（n＝5），表明本方法重复性良好。

2.5 稳定性试验 取供试品溶液，分别于0、6、12、18、24h进样，记录维生素B6的峰面积， 计算RSD为0.32%，表明维生素B6在24h内稳定。

2.6 检测限和定量限 取对照品溶液，经过一系列稀释，进样测定，以基线噪音的3倍计算，维生素B6的最低检测浓度为0.079 mg·L-1；以基线噪音的10倍计算，维生素B6的最低定量浓度为0.296 mg·L-1。

2.7 回收率试验 分别精密量取9份已测知含量的供试品（批号：2012090901）10ml置50ml容量瓶中，再分别精密加入对照品储备液2 ml、2 ml、2 ml、2.5 ml、2.5 ml、2.5 ml、3ml、3 ml、3ml，加流动相稀释至刻度，按样品含量测定项下方法测定，计算回收率，结果见附表1。

2.8 样品含量测定 取对照品溶液与供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进行测定，按外标法计算含量，并与紫外-可见分光光度法测定结果作比较（附表2）。

3 讨论

参照《中国药典》2010年版二部正文维生素B6原料的含量测定，适当调整有机相和水相的比例，采用0.04%戊烷磺酸钠 （用冰醋酸调节pH值至3.0）-甲醇（88∶12）为流动相，斑蝥酸钠维生素B6注射液样品的出峰时间适宜，峰形好，理论板数高。

采用二极管阵列检测器分别对供试品溶液和对照品溶液在200～350nm波长范围内进行3D图谱扫描，结果均在291nm有最大吸收，故选择测定波长为291nm。

由附表2可见，两种方法测定三批样品的结果基本一致，但吸收系数法因方法本身的专属性不高，易受测定环境、仪器性能及样品中含有在291nm波长处有紫外吸收的其他物质的干扰。而高效液相法的专属性强，更适用于测定斑蝥酸钠维生素B6注射液中维生素B6的含量。