小鼠成纤维样滑膜细胞原代培养的影响因素研究

唐 媚，常 山，曹宗锐，罗兴燕，胡 松，唐信威，王衍堂，刘 阳，邹 强

0 引 言

成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes，FLSs)是组成滑膜层的最大细胞群体，在维持关节正常生理功能和内环境稳态方面发挥重要作用［1］。异常增生活化的FLSs在关节病变中起关键性作用，其已广泛应用于关节疾病发病机制的研究中［2］。目前已建立了较为成熟的体外人［3-4］、大鼠［5-8］FLSs培养体系，主要有组织块培养法［9］和酶消化法［10］。近年来基因敲除小鼠越来越广泛地应用在关节疾病研究中［11］，培养小鼠FLSs的方法现已有报道［12］。然而影响体外培养原代小鼠FLSs数量和纯度的因素较多，如关节处理方法、消化酶种类、酶消化时间等。目前关于此类影响因素研究的报道较少。本研究在体外培养小鼠原代操作过程中，发现影响FLSs数量与纯度有3个主要因素:关节处理方式、消化酶种类及酶消化时间，并对其进行探讨，为获得高数量、高纯度FLSs提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康SPF级C57雄性小鼠，6月龄，12只，体重20～30 g，由成都医学院动物中心提供，实验动物合格证号:0017184，在独立通风鼠笼IVC系统饲养，给予标准饲料和饮用水，用于分离培养FLSs。

1.1.2 主要设备 超净工作台(苏州安泰);荧光倒置相差显微镜(Olympus);®流式细胞仪(BD公司)。

1.1.3 主要试剂 胎牛血清(上海普飞)，L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素(北京索莱宝)，2-巯基乙醇(美国Sigma);Ⅳ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶(Gibco)，流式抗体(BD)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠双后肢取材 将小鼠脱臼处死，置于75%乙醇中浸泡5 min。随后在髋关节处小心取下小鼠双后肢，保证关节面完整。将取得的小鼠后肢置于75%乙醇培养皿中浸泡5 s，用眼科剪纵行剪开皮肤至脚趾尖。用有齿镊、眼科剪分离皮肤、肌肉及筋腱;为避免骨髓细胞污染，操作过程不能出现骨断裂。将取得的组织用100 U/mL青霉素、200 μg/mL链霉素的PBS漂洗3次以减少污染。

1.2.2 后肢关节不同处理方法及Ⅳ型胶原酶消化随机数表法取6只小鼠，打开其关节处理:将去尽皮肤、肌肉的后肢置于无菌培养皿中，用手术刀依次打开趾关节、踝关节、膝关节，保证关节面完整;不打开关节处理6只小鼠:直接将小鼠后肢进行消化。消化过程为:将小鼠后肢置于离心管内，加入浓度为10 mg/mLⅣ型胶原酶(预实验初步判定Ⅳ型胶原酶转Ⅱ型胶原酶效果好)和含10%FBS的DMEM培养基。在37℃，转速200 r/min的摇床中孵育1 h，弃上清。向离心管内加5mLⅣ型胶原酶和20 mL DMEM完全培养基，在37℃200r/min摇床中孵育5h。取出离心管剧烈涡旋5s，收集上清液800g，离心5min。DMEM完全培养基重悬细胞转入24孔板内，置于5%CO2培养箱中培养。每隔1小时收集消化后的细胞悬液，连续收集7h(预实验结果表明:Ⅳ型胶原酶处理7 h后已将滑膜组织完全消化)。培养24h后，消化检测7h FLSs活细胞总数。

1.2.3 不同类型胶原酶消化对FLSs数量的影响将不打开关节的后肢置于2根50 mL离心管内，分别加入1 mL浓度为10 mg/mLⅡ型+4 mL DMEM、Ⅳ型胶原酶+4 mL DMEM完全培养基进行消化。每隔1小时收集消化后的细胞悬液，连续收集7 h。培养24 h后，消化检测每小时FLSs活细胞数。

1.2.4 Ⅳ型胶原酶消化时间对FLSs数量的影响Ⅳ型胶原酶消化不打开关节的双后肢，每隔1小时收集消化后的细胞悬液，连续收集7 h。培养24 h后，消化检测每小时FLSs活细胞数。

1.2.5 FLSs计数及鉴定 收集消化后的FLSs置于1.5 mL EP管内，加100 μL PBS重悬细胞。向管内加入0.5 μL APC-cy7 标记抗鼠 CD11b 抗体、0.5 μL FITC标记抗鼠CD90抗体，轻轻吹打混匀，4℃避光孵育25 min，再加0.5 μL 荧光染料孵育5 min，洗涤后，加100 μL PBS混匀上机检测。

1.3 统计学分析 采用SPSS 14.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示，2组均数比较采用t检验，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 流式细胞术鉴定 Ⅳ型胶原酶消化培养24h后，倒置显微镜下观察FLSs形态多为梭形、菱形;而巨噬样滑膜细胞(macrophage like synoviocyte，MLS)多触角形态极不规则。培养第4天，镜下观察FLSs呈放射状生长，明显可见长满触角的MLS。第2代FLSs体积逐渐增大，伸展更充分，仍可见MLS。第3代表现出典型形态，MLS数量明显减少。第4代FLSs形态上鉴定基本为成纤维样细胞，细胞核呈椭圆形位于细胞中央且状态良好，偶见单个MLS。见图1。

图1 倒置显微镜下观察小鼠FLSs形态(×20)Figure 1 Morphology of mouse FLSs under the inverted microscope(×20)

将培养24 h和第3代的FLSs消化制成细胞悬液，分别用抗鼠 CD90.2、抗鼠 CD11b流式抗体双染。MLS表达 CD11b，FLSs和 MLS表达 CD90.2。结果显示:24 h细胞悬液中抗鼠CD11b阴性细胞比例为86.5%、第3代细胞悬液中抗鼠CD11b阴性细胞比例为97.3%。见图2。

图2 小鼠FLSs表面标记流式分析Figure 2 Flow cytometry analysis of the surface makers of the mouse FLSs

2.2 后肢关节处理方法对FLSs数量的影响 有报道采用打开关节处理方式培养小鼠FLSs［5］，但该处理不仅操作复杂且会造成FLSs损失。本实验结果显示:单后肢打开关节消化7 h FLSs总数为(19133±115)个，单后肢不打开关节消化7h FLSs细胞总数为(24933±503)个，两者差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.3 不同类型胶原酶消化对FLSs数量的影响 本文比较了2种胶原酶消化对FLSs数量的影响。结果显示:Ⅱ型胶原酶消化7 h FLSs总数为(18100±400)个，Ⅳ型胶原酶消化7 h FLSs细胞总数为(24 900±500)个，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.4 Ⅳ型胶原酶消化时间对FLSs数量的影响 Ⅳ型胶原酶消化单支后肢，连续收集消化1～7 h细胞悬液，活FLSs数分别为(700±300)、(600±100)、(15200±900)、(5100 ±800)、(2700 ±300)、(900±200)、(300 ±100)个。结果显示，消化1、2 h，FLSs的数量较少，消化3 h的FLSs数量最多，之后数小时消化FLSs数量逐渐减少。见图3。

图3 Ⅳ型胶原酶消化时间对FLSs数量的影响Figure 3 Time of type-Ⅳcollagenase digestion in correlation with the number of FLSs

3 讨 论

越来越多研究表明，FLSs在关节疾病发病进程中扮演至关重要的角色［12］。被激活的FLSs一方面分泌基质金属蛋白酶，侵蚀软骨和骨组织，引起关节畸形;另一方面FLSs分泌趋化因子、炎性细胞因子，引起关节炎症。基因敲除小鼠能用于某特定基因功能的深入研究，为寻找新的治疗方法提供了基础，这使得越来越多的学者开始关注其在关节病变中的研究。而建立高效率、短周期体外培养小鼠FLSs方法直接影响到后续实验。因此进行培养条件优化，提高原代FLSs数量及纯度是很有意义的。

有文献报道采用打开关节处理方式培养FLSs［5］。本实验比较打开关节处理和不打开关节处理2种方法。结果显示:不打开关节处理获得FLSs数量显著高于打开关节处理。在操作过程中发现:手术刀依次打开各关节时，不可避免会造成FLSs损失，而不打开关节处理不仅减少实验者的操作步骤，也有效避免了骨髓细胞污染。本实验结果显示，Ⅳ型胶原酶消化获得FLSs数量显著高于Ⅱ型胶原酶消化的数量，分别收集Ⅳ型胶原酶消化7 h细胞悬液培养24h后检测，1h几乎无FLSs;2h的数量开始增多;3 h的数量达到最高;4～6 h的FLSs数量逐次减少，7 h的FLSs降到最低，因为消化1、2 h关节腔尚未完全打开，悬液肉眼可见大量成絮状的筋腱和肌肉，影响FLSs贴壁和增殖，建议弃去。消化3 h关节腔完全打开，FLSs数量最多，而7 h的FLSs数量太少。因此我们收集2～6 h的悬液进行培养。原代细胞纯度相对较低，我们根据MLS贴壁紧、消化时间长(MLS需消化8～10 min，FLSs 4～5 min)且在体外不增殖的特性，逐代将其去除。第3、第4代FLSs纯度可达到95%以上，能满足后续实验需要。关于鉴定FLSs，有文献报道可采用PCR扩增其标志性细胞骨架蛋白波形蛋白基因［13-14］，也可采用FLSs表面标记物标记后流式细胞仪检测［3，7］。因细胞表面标记物鉴定目标细胞特异性高且操作简便，现越来越多学者采用流式细胞术检测和鉴定细胞［15-16］。尽量避免采用多次取材得到的FLSs进行实验，以减少批间误差，反映真实结果。

除本实验比较的3个因素外，还有其他因素影响原代FLSs数量与纯度，如不同消化酶联合使用、消化时加磁珠等。实验人员在培养FLSs时，需综合考虑这些影响因素，提高工作效率，降低科研成本。

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