结直肠癌组织中MAGE基因启动子去甲基化状态与其mRNA表达的关系

严茂军，周怀愉，夏 辉

（1临沂市肿瘤医院，山东 临沂 276001;2山东大学基础学院）

黑色素瘤抗原（MAGE）基因编码的抗原肽能够被自体细胞毒T淋巴细胞识别并杀灭，达到消除肿瘤细胞的目的，是肿瘤免疫治疗理想的靶抗原［1］。有研究发现，MAGE基因亚家族在多种恶性肿瘤组织中低表达限制了其抗原作为肿瘤免疫治疗靶点的价值，而其启动子去甲基化可使MAGE基因重新激活表达［2，3］，故应用甲基化抑制剂可提高其表达和临床应用价值。为探讨MAGE基因启动子去甲基化对其基因表达的影响，我们应用RT-PCR、甲基化特异性PCR（MSP）检测了结直肠癌组织中MAGE基因mRNA表达及其去甲基化状态，旨在为以此为靶抗原的免疫治疗提供理论依据。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择临沂市肿瘤医院2005年7～11月手术切除、经术后病理证实的原发性结直肠腺癌及相邻正常黏膜（距肿瘤边缘＞10 cm）组织标本各65份。其中患者男44例、女21例，年龄30～78岁、中位年龄55.0岁;结肠癌27例，直肠癌38例;TNM分期:Ⅰ期8例，Ⅱ期32例，Ⅲ期16例，Ⅳ期9例;有淋巴结转移18例，无淋巴结转移47例;所有患者未合并肝肺转移。术前均未行放化疗和免疫治疗，术后均行FOLFOX4方案化疗10～12个周期。

1.2 方法

1.2.1 MAGE-1、MAGE-3 基因启动子 mRNA 检测标本切除后即刻放入液氮冷却，后转存于-70℃冰箱。Trizol法提取组织总RNA（Invitrogen，美国），MAGE-1、MAGE-3基因扩增条件及引物参照文献［4］，GAPDH作内参照。以睾丸组织作为阳性对照研究。

1.2.2 MAGE-1、MAGE-3 基因启动子去甲基化检测 MSP方法检测各组织DNA去甲基化。DNA离心柱式抽提试剂盒（江苏海门市碧云天生物技术研究所）提取各组织DNA，EZ DNA甲基化试剂盒-Gold（D5005）（ZYMO RESEARCH，美国）检测各组织去甲基化状态。按试剂盒说明进行操作。MAGE-1、MAGE-3基因启动子去甲基化引物序列参照文献［5］。MAGE-1基因启动子去甲基化引物（U）:上游引物:5＇-TGTTAGGAAATATTTGGGTGTTTG-3＇，下游引物:5＇-AACATCTTCCCACAAATAAACC-3＇，扩增长度246 bp;甲基化引物（M）:上游引物:5＇-CGTTAGGAAATATTCGGGTGTTC-3＇，下 游 引 物:5＇-ACGTCTTCCCGCGAATAAAC-3＇，扩增长度 245 bp。MAGE-3基因启动子去甲基化引物（U）:上游引物:5＇-TGTTTGGAATTTAGGGTAGTATTGT-3＇，下 游 引物:5＇-CCATCACTCATTACTCAAAACAAA-3＇;甲基化引物（M）:上游引物:5＇-TTTGTTCGGAATTTAGGGTAGTATC-3＇，下 游 引 物:5＇-GTCGCTCGTTACTCAAAACG-3＇，扩增长度均为 104 bp。修饰后以DNA为模板进行PCR扩增，25 μL反应体系:样品DNA 2 μL，10 × PCR Buffer 2.5 μL，引物各 1 μL，dNTP 2 μL，TaqE 0.2 μL，双蒸水 16.3 μL。退火温度50 ℃（M）、50～51.5 ℃（U）30 s，35个循环。甲基转移酶处理和未处理的人外周血细胞DNA作为阳性和阴性对照。凝胶电泳分离扩增产物，自动成像仪成像分析。判断标准:仅出现甲基化条带为高甲基化，同时出现甲基化和非甲基化条带为半甲基化，仅出现非甲基化条带为非甲基化，高甲基化与半甲基化均计为甲基化阳性。实验重复3次。

1.2.3 统计学方法 采用SPSS18.0统计软件，计数资料以百分数表示，比较采用χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1MAGE-1、MAGE-3 基因启动子 mRNA 表达65份结直肠癌组织中MAGE-1、MAGE-3 mRNA表达率分别为 18.5%（12/65）、33.9%（22/65），53.8%（35/65）的标本至少表达一种抗原基因;相邻正常黏膜组织未见表达。

2.2 MAGE-1、MAGE-3基因启动子去甲基化状态65份正常黏膜组织中MAGE-1、MAGE-3基因启动子甲基化率均为100%，但分别有1.5%（1/65）和4.6%（3/65）正常黏膜出现去甲基化;而结直肠癌组织中MAGE-1基因启动子去甲基化率为29.2%（19/65），MAGE-3基因启动子去甲基化率为47.7%（31/65）。61.5%（40/65）的标本至少一种基因存在去甲基化。

2.3 MAGE-1、MAGE-3基因启动子去甲基化状态与其mRNA表达的关系 65份结直肠癌组织按去甲基化有无分为去甲基化组和甲基化组。MAGE-1去甲基化组mRNA表达率为57.9%（11/19），高于甲基化组的2.2%（1/46）;其去甲基化与mRNA表达相关（χ2=24.155，P＜0.05）。MAGE-3 去甲基化组 mRNA表达率为64.5%（20/31），高于甲基化组的4.3%（2/46）;其去甲基化与mRNA 表达相关（χ2=24.899，P＜0.05）。见表1。

表1 MAGE-1、MAGE-3基因启动子去甲基化与其mRNA表达的关系

3 讨论

DNA甲基化可使RNA聚合酶Ⅱ转录的基因表达沉默，是抑癌基因失表达导致肿瘤发生的重要机制［6，7］。作为癌/睾丸抗原（CTA）家族的 MAGE 基因特异性表达于除睾丸和卵巢组织以外的各种肿瘤组织，其编码的肿瘤特异性抗原多肽能够被自体细胞毒T淋巴细胞识别，增强对肿瘤细胞的杀伤能力，成为肿瘤免疫治疗的理想靶分子［8］，但尚未发现结直肠癌特异性较好的靶点。

MAGE-1、MAGE-3基因是具有CTA基因家族共同特性的肿瘤特异性抗原，其表达与肿瘤的发生、转移及恶化相关，在不同的肿瘤组织中表达率也各不相同。胃癌、肺癌、肝癌等恶性肿瘤组织中MAGE基因表达率较高，而其表达率的高低可能直接影响到免疫治疗的效果［1］。同一种肿瘤常有多种MAGE基因亚家族的表达。如刘芳芳等［9］报道，结直肠癌组织中 MAGE-1、MAGE-3基因的表达率分别为5%、52%，并认为MAGE-3基因有可能成为结直肠癌免疫治疗的候选靶点。

已有研究表明，MAGE基因与癌基因以同样的方式通过去甲基化而重新表达［10］。Yanagawa等［11］研究发现，67例肺癌组织中MAGE-1、MAGE-3基因表达率分别为29.9%、38.8%，去甲基化率分别为41.8%、46.3%，其中20例 MAGE-1表达阳性组织中18例检测到去甲基化，而26例MAGE-3表达阳性组织中24例检测到去甲基化。因此，MAGE基因表达与启动子去甲基化密切相关，且去甲基化患者较甲基化患者预后差。检测肝癌组织中MAGE-1、MAGE-3基因去甲基化状态也得出了相似的结果，故其对肝癌的早期诊断具有较高的灵敏性和特异性［4］。本研究发现，19份结直肠癌MAGE-1基因去甲基化者11例检测到基因表达，31份结直肠癌MAGE-3基因去甲基化者20例检测到基因表达，并且其基因表达与启动子去甲基化密切相关。提示与其他类型肿瘤相似，结直肠癌组织中 MAGE-1、MAGE-3基因启动子去甲基化可能是基因重新激活表达的重要调节机制，可发生在肿瘤的早期、进展过程中，具有较高的肿瘤特异性，检测其甲基化模式有可能对肿瘤的早期诊断、疗效观察和预后判断提供有价值的信息。但并不是所有去甲基化的肿瘤组织均有基因表达。Kim等［12］观察32株结直肠癌细胞发现，MAGE-1、MAGE-3分别有59%、66%的表达，而检测到81%的细胞株出现去甲基化;87例正常黏膜组织中MAGE-1、MAGE-3均出现甲基化，但同时也发现2例和5例扩增出去甲基化条带。本研究也发现，正常黏膜组织MAGE-1、MAGE-3分别有1、3例出现去甲基化。推测可能有其他机制参与了基因表达的调节。Moreno-Bost等［2］认为，不仅 DNA甲基化，可能还有其他机制参与了MAGE基因表达的调节，如组蛋白修饰、miRNA。正常黏膜组织存在MAGE基因异常去甲基化，说明甲基化改变是结直肠癌发生的一个早期、频发的事件。

综上所述，结直肠癌组织中MAGE-1、MAGE-3基因启动子去甲基化可能是基因重新激活表达的重要调节机制，是结直肠癌发生的一个早期、频发的事件，检测甲基化模式可能有助于结直肠癌的早期诊断和预后判断。结直肠癌组织中MAGE-1、MAGE-3基因低表达可能限制了其抗原作为肿瘤免疫治疗靶点的价值，应用甲基化抑制剂可显著提高其表达和临床应用价值［2］。但结直肠癌组织中有无特异的低甲基化位点、甲基化与转录表达的确切机制及对判断预后的价值还不清楚，需要进一步的研究和探讨。

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