SN50对缺血再灌注损伤中TNF-α影响的实验研究

吴 勇，叶 芬，葛轶睿，陆 燕，魏锐利

缺血再灌注损伤的概念是指机体组织缺血一段时间，当血流再次恢复流通后，细胞的结构发生破坏，代谢功能发生障碍，甚至比刚缺血时更加严重，进而导致器官功能进一步损害的综合征［1］。眼部很多疾病都存在这种病理生理现象，如急性闭角型青光眼、视网膜中央动脉阻塞、糖尿病性视网膜病等血管的阻塞都可以引起缺血再灌注损伤性眼病［2］。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)主要是由活化的单核-巨噬细胞所产生的具有多种生物学效应的细胞因子，并且在组织和细胞炎症损伤中起着相当重要的作用，常常被作为组织和细胞炎症损伤及其严重程度的重要观察指标［3］。研究表明核转录因子-κB(nuclear factor-kappaB，NF-κB)是一种具有多种功能的核转录因子，被激活后可促进许多种炎症细胞因子及免疫基因的转录;而SN50则是一种NF-κB的活性抑制肽，具有很强的细胞膜穿透能力［4］，可以高效地、特异性地抑制 NF-κB 所诱导的下游基因表达。本研究建立缺血再灌注损伤的细胞模型，再将细胞模型在氧糖剥夺条件下进行培养，通过体外实验来观察和了解SN50对缺血再灌注损伤中TNF-α表达的影响，为眼部缺血性疾病的临床治疗提供理论探索。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 SN50(Biomy公司 美国)，TNF-α ELISA Kit(美国Invitrogen公司)，RPMI 1640培养液(美国Gibco公司)，胎牛血清(美国Gibco公司)，MTT(美国Invitrogen公司)，细胞培养瓶与细胞培养皿(美国Corning公司)，RORMA 3131三气培养箱(美国 Thermo Scientific公司)，HERAEUS PICO 17离心机(美国 Thermo Scientific公司)，FORMA 700超低温冰箱(美国Thermo Scientific公司)，ECLIPSE Ti倒置显微镜(日本 Nikon公司)，MULTISKAN MK3酶标仪(美国Thermo Scientific公司)。

1.2 动物的分组 取健康的成年SD大鼠30只，7～8周鼠龄，体重180～200g，由南京军区南京总医院比较医学科提供，实验动物使用许可证号:SYXK(军)2007-029。随机分为氧糖剥夺组、正常对照组及氧糖剥夺+SN50处理组，每组10只。

1.3 巨噬细胞的分组造模 各组大鼠先予巨噬细胞行原代培养，即以20 mg/mL戊巴比妥钠注射液按35 mg/kg剂量鼠腹腔注射麻醉。经腹主动脉放血，以大鼠眼球苍白为放血充分后，游离大鼠气管，固定PE软管，注射器抽吸后灌洗生理盐水，每次灌注生理盐水10 mL，充分灌洗大鼠的肺泡巨噬细胞。离心收获的生理盐水，800 r/min(离心半径8 cm)离心5 min，去除上清液，以细胞培养液重悬，并予肺泡巨噬细胞计数备用。用上述方法获取SD大鼠的肺泡巨噬细胞，将含有巨噬细胞的细胞培养液以800 r/min(离心半径8 cm)离心5 min，去除上清液，生理盐水洗涤2次。生理盐水重悬巨噬细胞，将巨噬细胞放入培养皿内。

氧糖剥夺组:把含有巨噬细胞的培养皿放在37℃、5%CO2+3%O2+92%N2的三气培养箱内。

正常对照组:把含有巨噬细胞的培养皿放入5%CO2，37℃，饱和湿度环境下进行培养。

氧糖剥夺+SN50处理组:将巨噬细胞放入培养皿后，加入 SN50，SN50的工作浓度为30 μM，再放入37℃、5%CO2+3%O2+92%N2的三气培养箱内。

三组均在培养 0 h、0.5 h、2 h、12 h 后，800 r/min(离心半径8 cm)离心5 min，收集细胞培养液及巨噬细胞进行各项测定比较。

1.4 MTT法检测细胞的存活率 用5 mL MTT溶剂溶解25 mg MTT，配制成5 mg/mL的MTT溶液，分装后放置于－20℃避光保存。于96孔反应板上每孔加入100 μL约104个细胞、MTT溶液100 μL，37℃继续孵育4 h后去除上清液。在酶标仪上选择490 nm检测波长，并用680 nm为参考波长，测定各孔的吸光值(OD)。按以下公式计算细胞存活率:

1.5 TNF-α的检测 用ELISA法检测正常对照组、氧糖剥夺组、氧糖剥夺+SN50处理组的巨噬细胞培养液中TNF-α的表达情况，按说明书操作并计算浓度。

1.6 统计学处理 检测数据使用SPSS 18.0软件进行统计学分析。定量数据以均数±标准差(±s)表示，成组设计多个样本均数比较采用One-way ANOVA方差分析，两样本间均数比较用t检验;定性资料以率(%)表示，组间比较采用χ2检验;P＜0.05为差异具有统计学意义。图表制作使用OriginPro 7.0 软件。

2 结果

2.1 MTT法检测的细胞存活率 在氧糖剥夺条件下培养，经过SN50处理与未经SN50处理的相比较，2 h及12 h的细胞存活率明显上升，经过SN50处理的细胞存活率分别为(90±7)%和(84±7)%，未经SN50处理的细胞存活率分别为(73±4)%和(51±3)%，两组同时点比较差异均有统计学意义(分别为 P ＜0.05，P ＜0.01)。

2.2 SN50处理后的TNF-α表达 本文观察到在氧糖剥夺条件下培养，0.5 h、2 h后TNF-α表达逐渐升高;在培养12 h后，TNF-α表达有明显的增高。同样在氧糖剥夺条件下，经过SN50处理后，TNF-α的表达上调幅度明显变小，其中2 h与未经SN50处理的相比差异有统计学意义(P＜0.05，图1)，到12 h这种差异更加明显(P＜0.01)。

图1 三组巨噬细胞培养液中TNF-α的表达情况

3 讨论

在缺血再灌注损伤过程中，各种细胞因子或炎性因子都会参与其中，有研究表明，在脑部的缺血再灌注损伤后，脑内的TNF-α在组织缺血再灌注后的表达会明显增加［5］;TNF-α可激活组织内的巨噬细胞、内皮细胞及小胶质细胞产生各种炎性代谢物，持续炎性反应［6］。TNF-α同时还可促进白介素-1(interleukin-1，IL-1)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)及粒细胞-单核细胞集落刺激因子，产生相互协同的炎性作用 ;TNF-α对毛细血管有非常直接的作用，不仅可导致微小动脉痉挛，而且还能增加毛细血管的通透性，加重外周白细胞的浸润，同时TNF-α还可导致内皮细胞的损伤［8］。

在正常情况下，NF-κB是以无活性的状态存在于细胞质中。当细胞受细胞外信号(如细胞因子、病毒、紫外线、氧自由基等)刺激后，IκB激酶复合体(iκB kinase，IKK)活化后将 IκB 磷酸化，使 NF-κB暴露了核定位序列，此时蛋白酶迅速降解磷酸化的IκB，而游离的NF-κB会快速移位至细胞核内，与特异性κB的序列结合，诱导相关的基因产生转录［9］;已有许多研究报道，NF-κB与缺血再灌注损伤有相当密切的关系，其可以诱导多种细胞因子或炎性因子的表达增加［10-12］。NF-κB 还能调控其他与血管发生有关的基因，包括编码TNF-α、血管细胞黏附分子－1(VCAM-1)以及胞间黏附分子-1(ICAM-1)的基因［12］等。也就是说这些因子由NF-κB调控，同时又可激活NF-κB而形成正反馈，使得缺血再灌注的损伤加剧，NF-κB与TNF-α两者之间存在有相互协调或是相互促进的作用。TNF-α由于在组织和细胞炎症损伤中起着相当重要的作用，所以常常被作为组织和细胞炎症损伤及其严重程度的重要观察指标［13］。本实验中，在氧糖剥夺条件下，经过了SN50处理后，巨噬细胞TNF-α的表达上调幅度明显变小，与未经SN50处理的相比差异有统计学意义(P＜0.01);而且SN50处理后的细胞存活率与未处理的相比差异亦有统计学意义(P＜0.05)。SN50作为一种可以穿过细胞膜的NF-κB抑制性蛋白肽类，特异性好，无明显的毒副作用，可以阻断NF-κB所介导的细胞信号的传导通路。根据SN50对TNF-α mRNA和蛋白水平的作用效果具有的一致性［14］，本文认为SN50主要是通过抑制NF-κB核的移位干扰了TNF-α的基因转录而导致其分泌的蛋白量降低。

眼部的缺血再灌注损伤性疾病非常多见，目前针对其发病机制的实验研究很多，形成各种各样的学说，有氧自由基学说、一氧化氮学说、钙通道学说、炎症反应学说、兴奋性氨基酸学说等等，但是还没有明确真正的发病机制。本研究从分子生物学的角度探讨发病机制及治疗对策，通过建立模拟缺血再灌注损伤的体外模型，虽然可在细胞水平研究取得一些比较理想的结果，然而由于实验本身具非整体性，细胞在体外培养时具有形态、理化因素的差异，体外的实验结果还需结合动物实验模型进行整体分析研究。

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