睾丸酮丛毛单胞菌3α—HSD的研究进展

吴兴海+刘靖靖+王建华

摘 要： 3α-HSD（3α-hydroxysteroid dehydrogenase）是睾丸酮丛毛单胞菌在以类固醇为唯一碳源时，产生的一种类固醇脱氢酶，也是降解类固醇的关键酶。本文对睾丸酮丛毛单胞菌3α-HSD基因的调控、酶蛋白结构与功能等生物学特点进行阐述，总结了3α-HSD蛋白的两种获得途径：天然提取和人工诱导表达途径。从技术可行性、实用性和成本控制等几个方面，分析比对二者的优势和不足。介绍和展望了睾丸酮丛毛单胞菌3α-HSD在血清总胆汁酸测定、转基因生物工程、环境或食品中类固醇类激素检测及环境修复等领域的研究现状和应用前景。

关键词：睾丸酮丛毛单胞菌；3α-HSD；研究进展

中图分类号：Q939.9 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.06.014

睾丸酮丛毛单胞菌（Comamonas testosteroni）存在于人体胃、肠道、尿液及土壤、泥浆、水体中，是一种严格需氧、非发酵的革兰氏阴性细菌。睾丸酮丛毛单胞菌由Talalay 等[1]首先从池塘泥浆中分离得到，当其生长在含有类固醇的培养基上或环境中存在类固醇底物诱导时，可产生多种类固醇脱氢酶和11种降解酶，其中之一是3α羟基类固醇脱氢酶（3α-hydroxysteroid dehydrogenase， 3α-HSD），一种能够利用分解甾体类和多环芳烃类化合物作为菌体生长所需要的碳源和能源的关键酶。

目前认为，3α-HSD不仅是睾丸酮丛毛单胞菌在以类固醇为唯一碳源时，产生的一种醇脱氢酶，也是降解类固醇的关键酶，还广泛地存在于原核和真核生物体内，是人体调节性激素代谢水平的重要酶类[2-3]。1998年研究人员发现睾丸酮丛毛单胞菌的降解酶3α-类固醇脱氢酶在降解消化甾类物质中起主导作用，并对这个基因的调控机理进行了初步研究，认识到3α-HSD是C19～C27类固醇分解代谢途径中最初的酶之一[4]。在过去15年的时间里，睾丸酮丛毛单胞菌3α-HSD的结构和调控研究得到长足进展，其作用机制和功能的奥秘被逐步揭示，在几个关键领域的应用研究已取得显著成果。笔者拟就3α-HSD的研究进展结合自身研究项目进行简要综述，以期进一步系统了解睾丸酮丛毛单胞菌3α-HSD的表达调控机理，为今后拓宽其在环境修复、食品安全、医学检验研究领域的应用作以铺垫。

1 3α-HSD的生物学特点

1.1 3α-HSD基因的调控

3α-HSD基因全长774bp，编码258个氨基酸的肽链，肽链分子量在26.4KD左右。3α-HSD的表达过程较为复杂，在转录水平受多个因子调控，从最初的负调控因子阻遏蛋白RepA、RepB和活化因子Activator，到近年来发现的正调控因子TeiR基因和LysR基因，都对其转录过程起到抑制或促进作用。

1.1.1 阻遏蛋白（RepA和RepB） 在3α-HSD基因附近有4个开放的阅读框架（orf l、orf 2、orf 3、orf 4），与基因的诱导、表达与调控密切相关。3α-HSD基因受2个阻遏蛋白（RepA和RepB）的负调控，类固醇通过阻断阻遏蛋白与调控区的结合，诱导3α-HSD的表达[5]。Rep A和Rep B分别由420和78个氨基酸组成，由框架orf 2 和 orf 3编码。Rep B可与3α-HSD mRNA的5端环状结构相结合，其编码框orf 3的方向与3α-HSD方向相反。RepA识别位点有两处，RepA与这2个序列结合，形成一个1.6 kb的环状结构，阻遏了细菌RNA聚合酶与hsd A启动子区域的结合，从而抑制3α-HSD基因的表达。国内外学者的研究表明，去除这2处DNA序列可显著提高3α-HSD基因的表达，而类固醇等甾体类诱导剂的加入可全面抑制阻遏蛋白RepB和3α-HSD基因mRNA的结合及RepA与顺式操纵子双位点的结合，从而促进3α-HSD基因的表达和翻译过程的顺利进行。

1.1.2 正调控因子 Activator是与增强子或与活化因子结合区域结合的蛋白，是一种在启动子上可以增加转录起始速度的DNA结合蛋白[6]。当活化因子与下游基因的启动子的活化因子结合部位结合后，就能促使更多的RNA聚合酶集聚到下游基因的启动子附近，提高下游基因的转录起始速度。研究表明，在C.testosteroni染色体上编码3α-HSD基因上游的2.6 kb处存在activator基因，该基因全长为564 bp。通过研究可以发现，利用睾丸酮丛毛单胞菌的activator 能提高3α-HSD/CR转录速率，通过将强启动子整合入C. testosteroni染色体中，使强启动子位于activator基因的上游来加强该细菌activator基因的表达，最终加强下游一系列基因表达的构想是可行的[7-9]。

类固醇诱导蛋白（testosterone-inducible regulator，teiR）基因和LysR基因是近年来被研究发现的3α-HSD基因正调控因子[10]。2004年，一种用于降解类固醇新的睾丸酮丛毛单胞菌蛋白被研究人员发现，中文译为睾丸酮诱导调节子[11]。TeiR序列在C末端保留了螺旋-转角-螺旋 （Helix-turn -helix， HTH） 式的LuxR基因DNA结合区域。与LuxR相似蛋白相同，该蛋白与目的基因转录起始点上游lux盒结合后可以激活或抑制目的基因的转录。国内外学者的多个研究同时表明[10-11]，在培养基中加入类固醇进行诱导的情况下，在基因表达过程中teiR基因紧密地控制着转录水平，而一个teiR缺失的突变菌株无法以类固醇作为单一的碳源。值得注意的是，在teiR缺失的突变体中3α-HSD基因也失去了降解类固醇的功能。这可能是由于突变体中，睾丸酮无法与teiR N端自主诱导物结合区域进行结合而不能进入细胞体内，从而抑制了睾丸酮与阻遏物结合诱导关键酶3α-HSD表达的能力，最终导致突变体丧失了正常的降解功能。利用反向对比实验可以发现当teiR基因插入到teiR缺失突变体菌株后，3α-HSD基因转录水平得以恢复。通过以上研究不难看出，teiR基因对睾丸酮丛毛单胞菌的酶解类固醇基因的转录过程进行正向调控，是3α-HSD等类固醇降解基因的mRNA完全表达的重要组成原件。大肠杆菌的共转化试验支持了这一观点，teiR基因与带有3α-HSD /CR基因的载体质粒后，结果发现在共转化的大肠杆菌中3α-HSD的表达明显高于单独转化的3α-HSD[11]。

2010年，继teiR基因后，在3a-HSD / CR 基因下游3.36 kb 处又发现了大小为912 bp 的LysR 基因[12] （ 赖氨酸调节子） ，而其所属LysR-类转录调节子（LTTRs）是原核生物最大的调节子家族。LTTR TsaR 蛋白无论是处于无配体形式还是复合形式都呈现为一个四元结构，与Ralstonia eutropha的CbnR，或Pseudomonas aeruginosa的LysR类调节子等明显不同，只有LTTRs是独特的四聚体形式。虽然3种蛋白都是头接头的四聚体环形，但TsaR呈现出一个开放结构，而CbnR 和 PA01-PR蛋白却是以C末端相对连接的方式闭环。明显的差异体现了LTTRs四聚体的自身灵活性，也是由于结构上更广阔的通用性所导致的结果。诱导物的结合能够带来LTTR结构发生变化，破坏封闭结构的两个C末端连接口。这导致TsaR-类蛋白结构被迫展开，形成双螺旋结构，拉近彼此距离。在国内Li等[13]的研究也证明将LysR基因可明显提高3α-HSD的表达量。

目前，这5个已发现的调控因子包括两个阻遏蛋白RepA、RepB和3个正调控因子都能够调节3α-HSD的表达水平，但是除阻遏蛋白和活化因子之间的作用机理较为明晰外（如图1所示），具体到5个因子之间作用关系是纵向关联还是横向调控，是时间关系还是空间关系都不得而知，作用原理有待于进一步的研究。

1.2 3α-HSD酶蛋白结构与功能

1956年，Talalay等首先证实3α-HSD是类固醇代谢途径中最初的酶之一，以后陆续从多种细菌等原核生物及动物、人体的真核细胞中发现了3α-HSD，但真核和原核3α-HSD在结构和功能等方面都存在差异较大。它们属于不同的蛋白质超家族，真核3α-HSD属于还原酶超家族[14]，而原核3α-HSD属于短链脱氢酶（SDR）超家族[2，15-16]。作为SDR超家族的新成员，3α-HSD酶蛋白在与其他成员的蛋白结构存在一定的差异、同源性较低的同时，保留了该家族的2个特征性保守序列：N-末端的SDR超家族的氨基酸指纹Gly-X-X-X-Gly序列与155～159氨基酸残基处的保守催化模块Tyr-X-X-X-Lys。睾丸酮丛毛单胞菌3α-HSD不仅对环境、食品中雄酮等类固醇基质和类固醇类抗生素-梭链胞酸进行降解代谢，还可以催化杀虫剂NKI 42255等非类固醇的醛及酮的氧化还原。3α-HSD酶蛋白有单体和双体两种形式，具体形式取决于浓度高低：浓度较高时，晶体结构为同源二聚体，对雄酮、四氢可的松、脱氧胆酸的活性大体相同，当浓度低时，二聚体解离为活性更高的单体形式，对雄酮有更高的降解活性。

2 3α-HSD蛋白的获得途径

从睾丸酮丛毛单胞菌中分离纯化天然3α-HSD需要包含以下多个步骤：首先将培养好的细菌裂解粉碎后，离心除去细胞残渣沉淀，然后用硫酸铵沉淀上清液，并将沉淀溶解、透析后用凝胶进行过滤层析，最后用等电聚焦电泳、亲和、离子交换层析进行纯化。为了避免酶活性的迅速丢失，必须在提取和纯化过程中控制活性影响因子。结合酶蛋白的特点，通过分析可以发现，这种蛋白获得途径主要存在3个缺陷：一是步骤繁琐，技术难度大，对操作人员的技术熟练度要求较高；二是受制于纯化过程中酶活性的丢失，酶蛋白获得率低，天然3α-HSD分离纯化成本高涨，价格昂贵，生产工艺的应用及产业化受到极大限制；三是难以有效分离β-HSD与3α-HSD。

由于天然3α-HSD价格昂贵，其使用范围受到了极大限制。鉴于这种情况，国内外的研究人员将目光放到了3α-HSD的人工诱导合成领域。随着现代分子生物学技术和基因工程的不断发展和成熟，以3α-HSD基因为基础的融合蛋白高效原核表达系统的建立工作得到了充分的发展，依托于不同质粒载体的多种单价或多价表达调控体系被开发研制成功。众多国内外学者[2，17-18]在人工诱导3α-HSD 融合蛋白领域都进行了探索，开展了大量实验，利用不同的载体将各国不同来源睾丸酮丛毛单胞菌3α-HSD基因片段，在大肠杆菌中进行原核表达，都取得了很好效果。有些研究通过诱导表达并利用金属螯合层析纯化后可得到纯度大于98%的人工蛋白，有些研究融合蛋白的酶比活性是对照菌的十余倍。

在实际过程中，笔者发现在前人研究的基础上，摸索优化的表达条件和实验参数，建立最优的表达调控系统对于提高人工合成融合蛋白的效率具有直接的影响。笔者所在课题组 [19]利用分子克隆的方法扩增与克隆睾丸酮丛毛单胞菌ATCC 11996的3α-HSD基因，构建表达工程菌，通过优化表达菌的最佳表达条件得到目的蛋白。通过优化纯化条件，建立了3α-HSD的60%硫酸铵沉淀-亲和层析-分子筛分离的高效纯化方法，可以获得具有酶活性的纯度高达99%的3α-HSD，为课题的后续研究打下了坚实基础。

3 3α-HSD的应用研究

3.1 用于血清总胆汁酸（total bile acids， TBA ）酶循环测定（enzymatic cycIing method）

胆汁酸是3α-HSD的作用底物之一，随着肝功能损伤程度浓度提高，临床上用天然3α-HSD作为工具酶来测定人血清中的总胆汁酸浓度[20]。自从20世纪70 年代由睾丸酮丛毛单胞菌中提取到高纯度3α-HSD后，TBA 酶法测定逐步发展起来。第四代的TBA 酶学测定方法是酶循环测定法[21-22]，用底物和辅酶的反复反应，使待测物的量随时间的延长而不断增加，从而提高了检测灵敏度，且反应产物无污染，是一种非常有应用前景的测定方法（图2）。研究人员[20，23]参考日本Asahi Chemical公司的有关资料，基于用脱氢酶-辅酶体系循环底物的原理，通过优化实验，建立了灵敏度高，线性、精密度好，几乎无干扰，血清总胆汁酸（TBA）测定的酶循环法，是一种理想的TBA测定方法。

但是，从前文可知，TBA 测定中所用的工具酶3α-HSD 均从睾丸酮丛毛单胞菌中直接提取而来，天然提取的诸多固有缺陷无法绕开[24]。这导致了国内以3α-HSD为核心成分的第四代TBA循环检测技术在实际应用过程中，只能依靠从国外进口的昂贵试剂，在一定程度上限制了TBA 测定的临床推广。目前，随着3α-HSD人工融合蛋白的原核表达技术日臻成熟，而融合蛋白的活性与天然3α-HSD基本相同，建立以融合蛋白为工具酶的血清TBA 酶学测定法的研究仍处于空白阶段，从经济价值和应用价值上来说都具有可观的发展潜力，可作为下一阶段的研究热点。

3.2 3α-HSD转基因体系的建立

将外源基因导入到生物基因组 DNA 中，并在生物体内稳定的遗传，获得具有特殊功能的生物是当前生物基因工程的主要研究热点之一。研究人员先后将3α-HSD和aiiA基因以双基因融合载体的形式通过农杆菌介导法转入烟草和水稻中，检测融合蛋白的表达和生物活性后发现目的蛋白含量显著高于对照，获得具有双基因优点的烟草和水稻新种质[25-26]。Zhang等[27]通过农杆菌介导法将含有 3α-HSD 基因的载体导入到果蔗基因组DNA 中，获得阳性植株。对转 3α-HSD 基因的果蔗叶片进行 ELISA 检测，检测结果表明：3α-HSD 基因在转基因果蔗基因组 DNA 中得到表达，3α-HSD 蛋白的表达量高于对照。转基因果蔗的类固醇降解率高于对照，平均降解率达 80%左右，高于对照 25%左右。

为充分发挥3α-HSD对环境污染物中的类固醇化合物的降解作用，这些研究通过基因枪法等转基因技术将含有 3α-HSD 基因的载体导入到植物基因组 DNA 中，获得目的阳性植株。对转基因植株进行类固醇降解实验，与理论上预期效果完全一致，实际过程中转基因阳性植物对于类固醇类物质的降解率明显高于阴性对照。

3.3 利用3α-HSD单克隆抗体检测环境或食品中类固醇类激素及兽药残留

关于类固醇类激素检测的文献报道较多[30-31]， 主要使用的常规检测方法有高效液相色谱法、液/质联用法、气/质联用法等。但液/质联用法高昂的仪器和维护保养成本高、气/质联用法操作复杂、占用时间长[32]。试剂盒和酶联免疫法只能针对单种成分等缺陷，使其在应用于大量样品实施初筛和监测工作中受到了限制。因此，开发多残留分析的高通量检测对于大规模样品检测任务是迫切需要的。

在睾丸酮丛毛单胞菌降解甾醇类化合物类固醇的过程中，随着甾体类激素等诱导剂浓度的提高，阻遏蛋白的被抑制程度随之增加，而3α-HSD的翻译表达量相应提高，在一定范围内形成了与甾体类激素含量线性关系。C. testosterone 如作为在环境检测中的指示菌种，通过ELISA 方法检测其对3α-HSD蛋白的表达量，可以准确地对环境样品中睾丸酮或类固醇类激素的定性以及定量检测。3α-HSD 是作为降解甾体化合物的关键酶，在检测中可作为目标蛋白为利用生物学方法检测环境中类固醇类化合物的含量。研究人员[33]利用3α-HSD单克隆抗体，建立了水体或饲料中总甾体激素含量的双抗夹心酶联免疫反应（ ELISA）。当甾体激素的量在0.5～600 μg·g-1之间，与3α-HSD酶表达量具有明显线性关系。

目前，为建立广谱的激素筛查技术，笔者所在课题组在前文所述的高纯度蛋白基础上，已研制出高效价比的3α-HSD单克隆抗体。与传统的HPLC技术在灵敏度方面进行比较，建立于高效价比基础上的双抗夹心ELISA法具有高灵敏度和高通量等特点，可以同时检测睾丸酮及与其结构类似的一类物质的量。在样品多成分检测中，这种新型的甾体激素检测方法虽然无法专一性检测某种特定成分，但可用于监测环境中甾体激素污染整体情况和食物、饲料中类固醇类有害成分的快速初筛[34]。

4 结语与展望

由于人类工业革命的发展，大量的激素类化合物被排放到空气、水、土壤中，自然环境承受多种污染破坏，农业生产和自然生态平衡面临着巨大压力。这些有毒化学物质通过食物链的转移以及生活中直接接触吸收等多种方式，直接或间接地威胁着处于食物链顶端的人类，包括雄酮等类固醇类激素物质诱导造成的癌症、不孕症等各类疾病，是人类健康的大敌[28-29]。由于3α-HSD是睾丸酮丛毛单胞菌（C. testosteroni）的关键酶，即具有脱氢降解功能又可以起到还原作用，尤其是经过改良后的各类工程菌在保证稳定性的前提下将具有广泛的应用范围。在环境修复领域，3α-HSD可在农业上作为饲料食品添加剂及含有芳类物质肥料的降解物.还可以消化雌性激素类物质及动植物分泌的生理活性物中难降解多环芳烃类和甾体类化合物，也可用于土壤、水源等环境因子的修复[35-36]。另外，在植物修复领域，根据植物通过吸收、降解以及根际圈降解等方式将彻底去除环境中污染物的功能，利用转基因技术将睾丸酮丛毛单胞菌中的降解关键酶基因 3α-HSD 导入到植物中去，弥补植物缺乏微生物的有机物降解能力，具有处理费用相对低廉、对环境扰动少和资源可持续利用的特点，会进一步提高生物修复的实际应用价值。在检测领域，通过制备高纯度的3α-HSD抗原和相应的多克隆与单克隆抗体，进一步建立和完善能够快速检测多环芳烃类和甾体类化合物的免疫学方法将有望成为新的重点研究方向。

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