一株健康仔猪肠道乳酸菌的筛选鉴定与饲喂安全性的研究

曹 珂，林丽萍，陈于陇，卢新民，叶明娥，吴国平*

(1.江西农业大学 食品科学与工程学院，南昌市农产品加工与质量控制重点实验室，江西 南昌 330045;2.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，广东 广州 510610;3.江西省赣州市农业和粮食局，江西 赣州 341000)

我国是抗生素生产大国，也是使用大国。我国每年约有9.7 万t 抗生素用于畜牧业，占抗生素年产量的46.1%，其中90%的抗生素被作为饲料添加剂［1-2］。过去的数十年，抗生素在提高动物健康水平，节约饲料成本，提高生产经济效益等方面发挥了重要作用。然而，大量抗生素在疾病预防与治疗方面发挥重要作用的同时，也给畜禽生产和肉品安全带来很大负面影响。抗生素在畜禽养殖中的副作用如耐药菌株的产生、药物残留、二重感染等一系列问题给动物健康带来威胁的同时，引起的食品安全风险更引起了人们广泛关注。基于此，越来越多的国家纷纷禁止或限制抗生素作为添加剂在饲料中的应用，研发新型、安全、替代抗生素的“绿色饲料添加剂"成为趋势［3］。

益生菌(probiotics)是有利于宿主肠道微生物菌群平衡的活菌。益生菌在促进人和动物的肠道菌群微生态平衡，抑制有害微生物，增进动物健康，提高动物长速和饲料转化率等方面都有帮助，并具有无残留、无耐药性等优点，成为抗生素替代品的一种理想饲料添加剂［4］。目前，作为饲料添加剂的益生菌主要有枯草芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌等［5］。屎肠球菌是一种兼性厌氧的乳酸菌，为肠道正常菌群，在哺乳动物出生的2～3 d 内即可成为肠道的优势菌群。屎肠球菌具有生长速度快，有较好的黏附能力，可产生乳酸和一些抗菌物质。美国FDA 早在1989 年就将屎肠球菌列为可直接添加于动物饲料的菌种之一。目前，在养殖场已有较广泛的实际应用［6-8］。

本研究从健康仔猪肠道中分离、筛选、鉴定了一株乳酸菌，并对其饲喂泰和乌骨鸡的安全性和促进生长作用进行了初步研究，以期为开发益生菌饲料添加剂提供新的菌株来源。

1 材料和方法

1.1 培养基

1.1.1 MRS 液体培养基 蛋白胨10 g，牛肉浸膏10 g，酵母浸膏5 g，K2HPO42 g，柠檬酸氢二铵2 g，葡萄糖20 g，乙酸钠5 g，Tween-80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，1 000 mL 蒸馏水，pH 6.8，115 ℃灭菌20 min。MRS 固体培养基在液体培养基的基础上加入1.5%的琼脂。

1.1.2 牛肉膏蛋白胨培养基 牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.4，121 ℃蒸汽灭菌20 min。

1.1.3 TSA 培养基 胰蛋白胨15 g，大豆蛋白胨5 g，NaCl 5 g，琼脂13 g，蒸馏水1 000 mL，pH7.1～7.5，121 ℃蒸汽灭菌10 min。

1.1.4 V-P 测定用培养基 蛋白胨5 g，葡萄糖5 g，NaCl 5 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0，121 ℃蒸汽灭菌20 min。

糖醇发酵培养基:蛋白胨5 g，牛肉膏5 g，酵母膏5 g，吐温-80 0.5 mL 琼脂5 g，蒸馏水1 000 mL，1.6%溴甲酚紫溶液1.4 mL，糖或醇10 g，pH6.8，121 ℃蒸汽灭菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的筛选、分离和鉴定 无菌操作条件下取健康仔猪回肠黏膜，用刀刮取回肠黏液，生理盐水稀释100 倍，取0.2 mL 接种于EC 培养基平板上，37 ℃恒温培养2 d，挑取表面光滑凸起，周边整齐，直径1.0～1.5 mm 的菌落，革兰氏染色镜检，筛选革兰氏阳性球形无芽孢菌落。将筛选菌株在MRS 平板上经多次划线培养至菌株纯。根据《常见细菌系统鉴定手册》［9］的方法对筛选、分离到的菌株进行生理生化指标测定。

1.2.2 分子生物学鉴定 采用试剂盒提取细菌DNA 作为模板，进行16s rDNA 基因PCR 克隆。PCR 扩增引物为27F(5’-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)，反应体系为25 μL(10×buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl21 μL，25 mmol/L dNTP 1 μL，27F 和1492R(各20 μmol/L)各0.5 μL，DNA 模板1 μL，Taq DNA 聚合酶0.3 μL，灭菌去离子水18.2 μL)，反应程序为:95 ℃5 min;95 ℃30 s，55 ℃45 s，72 ℃90 s，35 个循环。PCR 产物经琼脂糖电泳验证后，测序由北京鼎国生物技术有限公司完成。将测序结果在NCBI 上进行BLAST 同源比对分析，从中选出相似性高的菌株序列，构建系统发育树。

1.2.3 细菌生长曲线与产酸性能的测定 挑数环菌接种至5 mL 的MRS 培养基中，37 ℃摇床培养8 h作为种子液，按3%的接种量转接至新鲜MRS 培养基，37 ℃摇床培养，于不同时间取样。0～8 h 内每隔0.5 h 取1 次样，之后每隔4 h 取1 次样，测定每次取样的OD600吸光值与pH 值，记录数据。另外，将菌液适当梯度稀释，测定OD600吸光值，同时用平板菌落计数法测定菌液的菌浓度，绘制菌落浓度和吸光值对应的标准曲线。根据标准曲线绘制菌落生长曲线和pH 变化图。

1.2.4 胆盐的影响 用无菌生理盐水将胆盐配制成0%、0.1%、0.3%、1%的胆盐溶液，将种子液按2%的比例与不同浓度的胆盐溶液混合均匀，室温下分别作用1 h 和2 h，每个实验做2 个平行，MRS 平板菌落计数测定不同条件下的各样品菌落数，计算存活率。

式中:Nt为含猪胆酸盐作用后的MRS 培养基中活菌数;N0为MRS 培养基中的活菌数。

采用相似方法，测定细菌在pH 3、4、5、6 条件下作用1 h、2 h 的存活菌落数，以pH6.8 条件下的细菌作为对照组。

1.2.5 抑菌性能测定 用滤纸片法测定细菌对大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)的抑制能力。即取培养18 h 的大肠杆菌或金黄色葡萄球菌0.2 mL 涂布于固体培养基，用无菌镊子夹取充分浸泡WLEF-01 菌液的纸片等距离贴附在培养基上，37 ℃恒温倒置培养24 h，观察抑菌圈。

1.2.6 药敏性测定 将待测菌株涂布于培养基平板，将药敏试纸用无菌镊子贴附于平板表面，37 ℃培养24 h 后测定抑菌圈直径，根据药敏试纸说明书对结果进行分析。

1.2.7 饲喂鸡的安全性能测定 从江西泰和乌骨鸡原种厂购买健康的1 日龄泰和乌骨鸡112 只，随机分为对照组和试验组两组，每组4 个重复，每个重复14 只鸡，其中对照组饲喂市场购买的鸡全价饲料，试验组饲喂添加筛选菌约2×107cfu/g 的全价饲料。每组鸡饲养条件相同，自由采食、饮水，初始室温保持在33～35 ℃，此后每周降温2 ℃，直至降为25～27 ℃，湿度控制在55%～65%，共饲养12 周，统计两组鸡的成活率和生长性能。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的分离筛选、理化性能

本研究从健康仔猪肠道初步分离出8 株无芽孢产乳酸细菌，进一步体外筛选得到一株生长速度快的球菌，暂命名为WLEF-01。该菌株菌落呈圆形，直径1.0～1.5 mm，凸起，微白色，湿润，边缘整齐(图1A)。WLEF-01 革兰氏染色呈紫色，为革兰氏阳性菌，在光学显微镜下观察该细菌呈单个球形，显微测微尺测定其直径约0.8 μm，无荚膜，无芽孢(图1B)。

图1 WLEF-01 的菌落形态(A)和菌体形态(B)Fig.1 The colonial morphology(A)and the shape(B)of WLEF-01

WLEF-01 菌株的生理生化鉴定结果详见表1。由表1 可知，该菌株接触酶呈阴性，能在10～45 ℃下生长，在7% NaCl 条件下可以正常生长，发酵葡萄糖产酸，可以利用甘油、蔗糖、乳糖、甘露醇发酵。根据《常见细菌系统鉴定手册》［9］，初步鉴定该菌株属于乳酸菌。

表1 生理生化测定结果Tab.1 The results of physiological and biochemical characterization of WLEF-01

2.2 分子生物学鉴定

对菌株进行16S rDNA 基因克隆、测序，通过NCBI 中使用BLAST 软件比对，将相似度高的序列用Mega 软件编辑，通过UPGMA 计算法构建比对进化树，以清酒乳杆菌株23k(Lactobacillus sakei subsp.Strain 23k)作为外参，发现WLEF-01 菌株与屎肠球菌(Enterococcus faecium)相似度高达98.1%～99.2%(图2)，其中与屎肠球菌株Aus0004 同源性达99.2%，与清酒乳杆菌株23k 相似度达到95%，综合生理生化试验结果，确定该菌株为屎肠球菌(Enterococcus faecium)。

图2 WLEF-01 与10 株肠球菌的16S rDNA 同源性分析树Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences，showing the relationships between strain WLEF-01 and related bacterial species

2.3 WLEF-01 生长曲线及产酸性能

由图3 可知，WLEF-01 的延滞期约0.5 h，在0.5～5 h 为该菌株对数生长期，代时约为20 min，之后进入稳定期，稳定期维持很长时间，54 h 未见活菌数降低，说明该菌株稳定性良好。图3 还表明，培养基pH降低与菌体生长繁殖基本相伴随，5h 左右培养基pH 从6.8 降至5.0 左右，最终稳定在pH 4.5 左右，预示WLEF-01 分泌乳酸与菌体生长繁殖同步，为初级代谢。该菌株延滞期短，代时短，进入对数生长期快，稳定期长，产酸能力较强。这些特性有利于工业化生产，减少发酵时间，提高生产效率，节约生产成本。

2.4 胆盐和pH 对WLEF-01 的影响

由于动物消化道中存在胃酸和胆盐环境，能够抵抗较强的酸性环境和较高浓度的胆盐作用，是益生菌能在胃肠道中存活和正常发挥作用的先决条件。从图4A 可知，与对照相比，0.1%～1.0%的胆盐作用2 h后对WLEF-01 的生长没有明显影响，即使1.0%胆盐作用2 h 后，活菌数量约为对照组的88%，表明WLEF-01 对胆盐的耐受能力很强。动物消化道中的胆盐含量一般为0.03%～0.3%。该菌株在1.0%胆盐浓度下均有耐受能力，显示该菌株株进入消化道后具有对胆盐较强的抵抗能力，符合作为益生菌的要求。

图3 WLEF-01 的生长曲线和培养基pH 的变化Fig.3 The growth curve of WLEF-01 and The pH of medium

益生菌耐受动物胃内盐酸的作用是另一个重要指标。一般动物胃内空腹条件下pH 2-3，在进食时会进一步分泌盐酸，但因为食物充盈和中和作用会有一定缓冲作用。从图4B 可知，WLEF-01 在pH 3条件下作用1 h，活菌降低一个数量级;在pH 4 及以上时，活菌数量损失不大，未达数量级。益生菌添加入饲料中后，在饲料的缓冲和包裹下，耐受胃酸作用的能力会增强。

图4 胆盐(A)和pH(B)对WLEF-01 的影响Fig.4 The effects of bile salt(A)and pH(B)on WLEF-01

2.5 抑菌性能

选用常见的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌作为指示菌，测定WLEF-01 抑菌性能。从图5A 和图5B 可知，WLEF-01 对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用。

图5 WLEF 抑制大肠杆菌(A)和金黄色葡萄球菌(B)生长Fig.5 The inhibition of WLEF-01 on the growth of E.coli(A)and S.aureas(B)

2.6 药敏性

从表2 可知，WLEF-01 对庆大霉素、复方新诺明、壮观霉素、先锋霉素、苯唑西林、卡那霉素、林可霉素有耐药性;对氟哌酸、阿奇霉素、左氧氟沙星、头孢曲松有中等程度的耐药性;对青霉素、阿莫西林、青霉素烷砜钠、头孢拉定、土霉素等敏感。

表2 药敏测试结果Tab.2 The results of drug susceptibility of WLEF-01

2.7 饲喂鸡的安全性

整个饲养12 周期内，对照组的乌骨鸡在2 周龄时死亡2 只，试验组的乌骨鸡没有死亡，整个饲喂期间未见两组乌骨鸡的生长有差异，表明WLEF-01 添加入饲料中饲喂具有安全性。从表3 可知，对照组的乌骨鸡日增重、日采食量和料重比与试验组的相比有一定的提高，但未达显著水平(P＞0.05)。

表3 WLEF-01 对泰和乌骨鸡生长性能影响Tab.3 The effects of WLEF-01 on growth performance of Taihe silky fowls

3 讨论与结论

本研究从健康仔猪的肠道中成功分离、筛选到一株具有益生菌特性潜力的球菌WLEF-01，经形态学观察、生理生化特征鉴定和分子生物学鉴定，该菌株为屎肠球菌。屎肠球菌在环境中广泛存在，属于肠道共生菌群，在很多刚出生2～3 d 的动物肠道即可成为优势菌群。屎肠球菌属于兼性厌氧的乳酸菌，与严格厌氧、培养保存条件苛刻的双歧杆菌相比，更适合于培养和生产中的实际应用。因此，1989年美国FDA 将屎肠球菌作为可直接添加用于饲喂动物的菌种之一［9-10］。

根据WLEF-01 的生长曲线，其延滞期约为0.5 h，0.5～5 h 为对数生长期，代时约20 min，表明该菌株潜伏期短，生长速度快。据王婷婷［10］和刘虎传［7］的报道，分离的乳酸菌延滞期大约为4 h 后才进入对数期。细菌的延滞期短，代时短，在生产应用上可以提高生产效率，减少成本，提高产品竞争力。同时，益生菌分裂代时短，进入动物肠道繁殖速度快，可在数量上迅速占优势，有利于拮抗病原菌的生长繁殖，是益生菌抑制病原菌的一个重要特性［11］。作为饲料添加剂使用的益生菌，一般要具备较强的耐受动物消化系统中的胆盐和胃酸作用能力，到达小肠后段存活下来才能发挥益生的功能。WLEF-01 在1%胆盐中作用2 h 对其存活影响很小，预示该菌株具有很强的耐受动物消化系统中胆盐作用的能力。WLEF-01 在pH3 条件下作用2 h，活菌数降低一个数量级，但当pH 大于4 时，该菌株损失较小，耐受能力较强。图3 显示WLEF-01 进入稳定期pH 约4.5，可以维持很长时间活菌数不降低，验证了该菌株在pH 大于4 时稳定性良好。王凡等［12］报道分离的屎肠球菌ZW002 在pH2 和pH 3 分别作用3 h 后的存活率为79%和81%，在胆盐0.3%作用2 h 后的存活率为78%。一般动物胃内环境pH 2～3，但食物对胃部环境有一定的缓冲作用和中和作用，这可以提高益生菌对酸的抵抗力［13］。此外，还可以通过加大添加量或采取菌种包被技术等措施，提高菌体对酸的稳定性和发挥作用浓度。

该菌株对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用。ZW002 菌株对致病性大肠杆菌K88、K99的抑菌作用较强［12］。屎肠球菌作为一种乳酸菌，可分泌乳酸直接抑制有害菌株生长繁殖，同时也有利于促进动物肠道内的乳酸菌、双歧杆菌等有益菌的生长繁殖，从而提高肠道菌群平衡的调节能力［13-14］。本研究表明，WLEF-01 对青霉素、头孢拉定、土霉素等抗生素敏感，但对庆大霉素、复方新诺明、壮观霉素、林可霉素等有耐受性。WLEF-01 对养殖中常用的抗生素有一定耐受能力，为其在养殖生产中的应用提供了有利条件。一个菌株能否作为一种益生菌，首要的是饲喂动物具有高度的安全性［15］。根据文献报道的一般益生菌添加剂量［10-15］，本研究将WLEF-01 以较高浓度(2×107cfu/g)添加入全价鸡饲料中，饲喂泰和乌骨鸡从0 周直至12 周可以上市销售，整个饲喂期间未见对泰和乌骨鸡有任何危害和不良影响，初步表明该菌株具有较高的生物安全性。同时，WLEF-01 对鸡的采食量、日增重和料重比有一定的促进作用，初步表明该菌株对乌骨鸡的生长具有益生作用。

本研究从健康仔猪肠道分离到一屎肠球菌WLEF-01 菌株，该菌株具有延滞期短，对数生长期快，稳定期长，耐胆盐能力强，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有一定的拮抗抑制作用，饲喂泰和乌骨鸡12 周龄期间安全性好，有一定的益生作用，显示该菌株具有作为益生菌饲料添加剂的开发应用潜力。

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